表达猪细小病毒VP 基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法技术

本发明专利技术涉及人工构建的伪狂犬病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰｒＶ）和猪细小病毒（ｐｏｒｃｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）的主要结构基因ＶＰ＃－［２］。在缺失了主要毒力基因（ＴＫ）和病毒增殖非必需基因（ｇＧ）的伪狂犬病毒基因组中，定位插入猪细小病毒的ＶＰ＃－［２］基因，使其位于伪狂犬病毒的强晚期启动子下游，插入的外源基因编码的蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激猪产生抵抗猪细小病毒和猪伪狂犬病毒两种强毒攻击的保护性免疫反应。本发明专利技术还包括重组的伪狂犬病毒Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＨｚａｕＡＶＬ－ＰＲｐｐｖＶ－ＶＰ２；保藏在ＣＧＭＣＣ，保藏日期：２００２年８月１６日，保藏编号：ＣＧＭＣＣ：０７８８－２，用其制备的疫苗及其制备方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于病毒学
，具体涉及一种人工构建的伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗株(PrV TK-/gG-/VP2+)，它的基因组存在两处基因突变，导致TK和gG基因失活，并利用DNA重组方法，在gG启动子下游定位插入了一个外源基因，该外源基因是猪细小病毒的主要结构基因VP2。本专利技术还涉及所述的重组基因工程疫苗及其该疫苗的制备方法。PrV一般经鼻咽部感染动物，并在感染局部的粘膜内增殖，然后经淋巴循环或神经纤维移行，一般认为病毒经神经通路到达脑而引起中枢神经功能紊乱，或在嗅球，三叉神经中建立潜伏感染。(Nauwynck等，In proceeding of PRRVS and Aujeszky’sDisease.1999，321-322)较强毒力的毒株还可扩散全身，并表现嗜组织特性，例如生殖道。PrV除了具有强烈的神经嗜性外，潜伏感染性也是其重要特征。Stevens等首次报道了HSV在大鼠中的潜伏感染(Science.1971，2669-2673)，Sabo和Rajcajm报道了PrV在猪的三叉神经节中发生潜伏感染，并检测到在猪的其它组织中也具有这种现象(Acta Virol.1976，20208-214)。潜伏感染期间，具有感染性的病毒粒子并不存在，但病毒基因组的一部分仍在活跃转录，潜伏感染中发生的转录也有蛋白质的翻译，这种蛋白质调节神经元的存活，进而影响潜伏感染与再激活之间的平衡。Osorio认为组织培养的MDBK(Main-Darby Bovine Kidney)细胞感染PrV后，可以产生典型的细胞凋亡Osorio(Osorio.In proceeding of PRRVS and Aujeszky’s Disease.1999，323)。利用鼻腔接种PrV造成猪的急性感染，在三叉神经节组织中，浸润的淋巴细胞发生典型的细胞凋亡，而神经组织细胞未发生凋亡，表明PrV可在不同类型的细胞中可以诱导或抑制细胞凋亡的发生，在急性感染PrV的动物的神经组织中，细胞的凋亡被抑制，这正是PrV逃避免疫和建立潜伏感染的一种重要机制(Aleman et al.，JVirol.2001，25469-479)。伪狂犬病毒的基因组为线状双链DNA，长约150kbp，G+C含量高达74％，整个基因组至少编码70-100个蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase，TK)基因位于UL区，全长963bp，编码320个氨基酸，催化脱氧胸苷磷酸化。TK基因与PrV的毒力有关，是伪狂犬病毒的一个主要毒力基因，与病毒的潜伏感染有关，已有证据表明它对病毒在中枢神经的增殖十分重要(Kit S等，Am J Vet Res.1985，461359-1367；Nunberg et al.，JVirol.1989，633240-3249)。TK基因是病毒增殖所非必需的，缺失病毒株与野毒一样能正常增殖，而且不存在毒力返强的危险(Yokyama等，Virol.1991，18555-65)。gG糖蛋白不存在于病毒囊膜上，而是分泌到感染细胞外，编码该蛋白的gG基因也是伪狂犬病毒增殖的非必需基因，缺失后，不影响病毒的增殖，突变病毒株具有很好的免疫原性，接种动物后可产生保护性免疫反应，但是不产生抗gG的抗体，因此可以作为区分免疫动物和野毒感染动物的一个标志，有利于建立无伪狂犬病感染的猪群，并最终为根除该病提供了有用的工具。众所周知，Mayr和Mahnel于1966年进行猪瘟病毒组织培养时首次发现猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)，开始认为是培养细胞内潜伏感染的病毒，Cartwright(1967)在对猪的繁殖障碍的病因学研究中，从病料中分离出了猪细小病毒，从而首次证实了该病毒的致病作用。猪细小病毒是细小病毒科细小病毒属的成员之一，也是猪繁殖障碍的主要病原之一，在世界范围内广泛流行，其危害主要表现为感染母猪，尤其是初产母猪流产、产死胎、木乃伊胎等，而其它年龄的猪感染后不表现明显的临床症状。在组织培养物中，同时存在空衣壳病毒和完整的病毒粒子。等将空衣壳病毒和完整的PPV病毒粒子按不同比例混合后接种猪睾丸细胞，结果发现，无论是细胞内还是细胞外成熟的病毒粒子数量均降低，同时血凝效价也大大降低，且抑制程度和PPV的空衣壳粒子数量直接相关(Choil et al.，Arch Virol.1987，9675-87)。此外，用PPV空衣壳病毒粒子以不同的浓度处理细胞，再用完整病毒粒子感染细胞，同样发现病毒的增殖受到严重抑制。PPV属于自主型细小病毒，基因组为单链线状DNA，共有两个开放阅读框架，一个编码非结构蛋白，另一个编码结构蛋白(VP1、VP2)，其中VP2是构成病毒粒子的主要衣壳蛋白，约占病毒衣壳蛋白总量的80％，细小病毒的主要抗原决定簇位于VP2上。血清学试验证实，VP2可以诱导产生血凝抑制抗体及中和抗体。此外，VP2蛋白还具有独特的生物学活性，其在体外表达后，不仅具有良好的抗原性，而且可以自我装配成病毒样粒子(Virus-Like Patricles VLP)，具有与全病毒相似的特征，例如其形态呈二十面立体对称结构，直径23nm左右，可以凝集豚鼠红细胞，将其接种动物后可以诱导产生强烈的免疫应答，可以抵抗PPV强毒的攻击，体外表达的VP2多肽能自我包装成病毒粒子的特性为重组多价亚单位疫苗的研究打下了坚实的基础。分别将PPV VP2和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸及乙肝病毒HBSAg的抗原决定簇区相连，利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应，在体内持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的相应病毒攻击。这些结果说明PPV VP2不仅是PPV的主要免疫原性蛋白，而且可以作为携带外源抗原决定簇多肽的蛋白质转运载体，为多价重组疫苗的研究创造了良好的条件(Sedlik等，Proc Natl Acad Sci USA，1997，947503-7508；Sedliket等，J Virol.1999，732739-2744)。伪狂犬病和猪细小病毒病，在世界各地造成了巨大的经济损失，严重地危害了养猪业的发展，研究发现疫苗免疫接种是预防和控制这两种疾病的发生、减少经济损失的关键。目前研制成功的有各自的弱毒活疫苗和灭活疫苗，疫苗的广泛使用不仅可以减少发病，而且可使PrV野毒潜伏感染再激活的现象大大降低。其中弱毒活疫苗易于生产，成本低廉，非常适合规模化养猪的需求。以前在研制弱毒活疫苗时常采用的方法是理化因素诱导及在培养细胞上连续大量传代而产生致弱病毒，这些均是不能控制的病毒突变，导致疫苗组成是非同源的混合物，其中含有未知毒力和未知保护力的变异病毒，而且这样致弱的病毒还存在毒力返强的危险。随着生物技术的飞速发展，对病毒结构及复制水平等方面的深入研究和基因工程技术大量应用于生物制品的研制中，通过对病毒基因组中的特殊区域进行改变，导致病毒致病性的减弱，克服了以前获得弱毒疫苗过程中的缺陷，更加简便快速、具有目的性地获得准确和稳定的弱毒疫苗。为了适应规模化养猪，降低生产成本，减少免疫接种对猪的应激反应(应激反应可以导致机体抵抗力下降，生长缓慢，并会诱发多种疾病的发生。)，需要大力研制多价疫苗，达到一针防多种疾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的基因工程疫苗毒株，其特征在于，该毒株是重组猪伪狂犬病毒：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＨｚａｕＡＶＬ－ＰＲｐｐｖＶ－ＶＰ２；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ），保藏日期：２００２年８月１６日，保藏编号：ＣＧＭＣＣ：０７８８－２。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈焕春，吕建强，赵俊龙，金梅林，何启盖，吴斌，方六荣，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]