本发明专利技术包括经修饰的通泉草查耳酮合成酶（ＣＨＳ）的核酸，该核酸编码一种经修饰的查耳酮合成酶，该合成酶在通泉草ＣＨＳ的１６５位残基的半胱氨酸被丙氨酸取代，１３８位残基的甲硫氨酸被甘氨酸或者赖氨酸取代。该被编码的修饰通泉草ＣＨＳ的特征在于其对ＣＨＳ的显性失活抑制。本发明专利技术还包括一些植物，这些植物具有至少一个表达该经修饰的通泉草ＣＨＳ的细胞。这样的植物的特征在于花色素苷含量降低。本发明专利技术还包括一些载体，这些载体含有该经修饰的ＣＨＳ核酸的至少一部分。本发明专利技术还包括一些方法，这些方法使用了这些载体以产生具有含量降低的花色素苷的植物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及经修饰的通泉草(mazus)CHS核酸，这些核酸编码经修饰的CHS酶，这些酶对CHS进行显性失活抑制，本专利技术还涉及这些序列对于遗传改变植物体以降低该植物中花色素苷的含量的用途。
技术介绍
花的颜色是一种重要的园艺学性状，该性状主要由类黄酮色素花色素苷产生。这些类黄酮主要为吸引传粉者而产生，还可以保护该植物及其生殖器官免于紫外线伤害、害虫以及病原体侵袭(Brouillard andCheminat，1988；Gronquist et al.，2001)。经典的育种方法已被用于开发不同颜色和色度的花的品种。近来在生物化学和分子水平上花色形成的知识的进展使得通过基因工程来进行开发成为可能(Tanaka et al.，1998)。在许多被子植物中，三类不同的花色素负责花色的深浅花葵素(橙色到砖红)、花青素(红色到粉色)、花翠素(紫色到蓝色)。花色素的生物合成途径已被熟知，而且多数参与该合成的酶已被鉴定(Holton and Cornish，1995；Winkel-Shirley，2001)。该途径始于4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A通过查耳酮合成酶(CHS)缩合形成四羟基查耳酮。该化合物通过查耳酮异构酶(CHI)和黄烷酮3-羟化酶(F3H)相继作用而转换成为二氢黄酮醇。最初所产生的二氢黄酮醇为二氢山奈素(DHK)。DHK随后通过黄酮醇合成酶(FLS)转化成为山奈素，或者通过二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)转化成为白天竺葵苷元。或者，DHK可通过类黄酮3’-羟化酶(F3’H)或者类黄酮3’5’-羟化酶(F3’5’H)被羟化成为二氢五羟黄酮(DHQ)或者二羟基杨梅黄酮(DHM)。DHR和DHM通过FLS被进一步转化成为它们对应的黄酮醇(五羟黄酮和杨梅黄酮)，或者被DFR还原而产生无色花色素(白矢车菊花苷元和白飞燕草苷元)。通过花色素合成酶(ANS)由无色花色素而合成的花色素随后通过类黄酮3-0-葡糖基转移酶(3GT)而进行糖基化以产生花色素苷。通过鼠李糖化、甲基化或者酰化进行的进一步修饰产生了多种多样的花色素苷(Kroon et al.，1994；Ronchi et al.，1995；Fujiwara et al.，1997；Yoshida et al.，2000；Yabuya et al.，2001)。花色的光谱差异主要决定于不同类别的花色素苷的比例以及其它因素，例如液泡的pH，色素共沉着、金属离子络合以及分子堆积(Holton et al.，1993；Markham and Ofman，1993；Mol et al.，1998；Tanaka et al.，1998；Aida et al.，2000)。最终的颜色深浅可能会受到多种因素的进一步影响，包括表皮细胞的形状或者产生乳脂色的淀粉的存在(Markham and Ofman，1993；Noda et al.，1994；Mol et al.，1998；van Houwelingen et al.，1998)。已经利用多种基因来尝试进行基因工程来该变花的颜色。由于缺乏该途径的某种生物合成基因或者缺乏某种酶的底物特异性，一些花种缺少某种特定的颜色。例如，由于F3’5’H的缺乏，康乃馨缺少蓝色/紫色的花，而矮牵牛由于其DFR不能还原DHK而缺少橙色和砖红色的花(Gerats et al.，1982；Forkmann and Ruhnau，1987)。蓝色/紫色的康乃馨的基因工程已经通过引入矮牵牛F3’5’H基因而完成，并且通过引入其它物种的DFR而开发出了橙色的矮牵牛(Meyer et al.，1987；Brugliera et al.，2000；Johnson et al.，2001)。对色度的调节已经成为基因工程的另一个目标。诸如CHS、F3H和DFR这样的生物合成基因以有义或者反义方向的表达已经成为最常用的方法(van der Krol et al.，1990；Courtney-Gutterson et al，1994；Jorgensen et al.，1996；Tanaka et al.，1998)。所导致的有义抑制或反义抑制被统称为转录后基因沉默(PTGS)。尽管这些途径在色素合成的下调中颇为成功，必须从特定物种或者密切相关物种中克隆目的基因是一个主要的缺陷。进一步，将PTGS限制于特定的组织中是很困难的(Palauqui et al.，1997；Voinnet and Baulcombe，1997；Voinnet et al.，1998；Fagard and Vaucheret，2000；Crete et al.，2001；Vaucheret et al.，2001)。另外，可激活或者抑制花色素苷生物合成基因的转录的转录因子在诸如鼠耳芥、烟草以及矮牵牛这样的模型植物中已被证明可用于调节色度(Lloyd et al.，1992；Mol etal.，1998；Borevitz et al.，2000；Aharoni et al.，2001)。但是，这些转录因子的过表达通常该变了许多基因的表达，由此，这样的转基因花的商业可靠性仍有待确认(Lloyd et al.，1994；Bruceet al.，2000)。CHS的生物化学和结构鉴定提出了设计一种显性失活CHS的可能性，该显性失活CHS可被用于色度的调节。CHS在包括花色素苷在内的多种类黄酮的生物合成中是第一个酶。它作为一种同二聚体发挥功能并在一个单一活性位点进行一系列的反应(Tropf et al.，1995)。该酶将一个分子的4-香豆酰辅酶A同三个分子的丙二酰辅酶A进行缩合并将该tetraketide中间体折叠成为一个芳香环结构(Schroder，1999)。定位诱变和抑制剂的研究已经鉴定出对于CHS的催化活性重要的保守半胱氨酸和组氨酸残基(Lanz et al.，1991；Suh et al.，2000)。紫花苜蓿CHS的晶体结构表明保守的Cys164、Phe215、His303和Asn336形成了催化活性位点(Ferrer et al.，1999)。另外，该晶体结构还显示，来自邻接单体的Met137伸入了CHS的环化袋。这提示一个CHS单体的活性需要来自邻接单体的甲硫氨酸。根据这一结构信息，我们已经制出了一种CHS，该CHS在活性位点上由丙氨酸取代了半胱氨酸并以甘氨酸或者赖氨酸取代了甲硫氨酸。半胱氨酸突变为丙氨酸将导致失活形式的CH5，而如果甲硫氨酸的功能果如晶体结构所提示的那样重要的话，甲硫氨酸突变为甘氨酸或者赖氨酸将使邻接CHS的功能失活。通过使用转基因的鼠耳芥，我们证实该突变CHS确实是显性失活的。我们的结果证实了该甲硫氨酸残基的重要性并且表明了该显性失活CHS在对花色强度的调节中的利用价值，即使是在一种远缘的物种中也是如此。因此，本专利技术的目的是提供经修饰的通泉草CHS，该CHS编码一种经修饰的查耳酮合成酶，该酶在通泉草CHS的165位氨基酸上由丙氨酸取代了半胱氨酸，并且在通泉草CHS的138位氨基酸上由甘氨酸或者赖氨酸取代了甲硫氨酸。本文的另一个目的为提供表达该经修饰的通泉草CHS的转基因植物，该通泉草CHS产生一种表型，其特征在于在该植物体内花色素苷的含量降低。专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的通泉草查耳酮合成酶（ＣＨＳ）核酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１），该核酸编码查耳酮合成酶（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：M翰南麻帕，崔高，崔吉柱，
申请(专利权)人：锦湖石油化学株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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