叶酸受体α特异性结合肽3及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种叶酸受体α特异性结合的短肽及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的多肽序列为SGVYKVAYDWQH。此多肽通过从噬菌体展示文库中筛选获得，可与表达叶酸受体α的肿瘤细胞特异结合，为肿瘤的靶向治疗以及肿瘤影像提供了一种新的靶向分子，具有新药开发的潜在价值。

Folate receptor alpha specific binding peptide 3 and its application

The invention relates to a short peptide of a specific binding of folic acid receptor alpha and its application, which belongs to the field of biotechnology. The polypeptide sequence of the present invention is SGVYKVAYDWQH. The peptide is screened from phage display library and can be specifically combined with tumor cells expressing folate receptor alpha. It provides a new target molecule for tumor targeted therapy and tumor imaging, and has potential value in new drug development.

【技术实现步骤摘要】
叶酸受体α特异性结合肽3及其应用
：本专利技术属于生物
，涉及一种叶酸受体α特异性结合的短肽及其在肿瘤靶向中的应用。
技术介绍
：噬菌体展示技术是将外源多肽或蛋白与噬菌体的某种衣壳蛋白进行融合表达，使外源蛋白能展示在病毒颗粒表面，同时使编码外源蛋白的DNA位于该病毒粒子内。随机十二肽噬菌体展示文库是将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，为一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端。这就在大量的随机多肽与其DNA编码序列之间建立起了直接的桥梁，再用各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)来进行体外筛选获得靶分子结合肽。体外选择程序简单来说就是噬菌体库与固相靶分子共孵育，洗涤去除未结合噬菌体，然后洗脱得到能与靶分子特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体还需进行扩增，进行下一轮的结合/扩增循环，来富集特异性结合噬菌体。经3～4轮“淘选”后，通过DNA测序可以得到每个特异性结合的多肽序列。叶酸受体(folatereceptor，FR)是结合并转运叶酸及其衍生物进入细胞的重要转运体，在体内主要以三种亚型存在：FRα、β和γ。叶酸受体α(folatereceptorα，FRα)是一种由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面的糖蛋白。已有文献报道，卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等组织中FRα呈高表达，而在正常组织中限制性表达，因此被认为是极具潜力的卵巢癌标志物或肿瘤相关抗原(TAA)；FRα对卵巢癌具有的高度特异性，可作为治疗相关肿瘤的靶点；部分研究也表明，FRα对于卵巢癌的早期诊断具有重要价值。基于此，若能得到与FRα具有较高亲和力的短肽序列，将为肿癌的靶向性治疗和诊断提供新思路。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于利用噬菌体展示技术获得一种能与叶酸受体α特异性结合的多肽。该多肽可用于靶向叶酸受体α表达阳性的肿瘤细胞。技术方案为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：1)噬菌体展示肽库的亲和筛选：以叶酸受体α重组蛋白为靶标，运用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物筛选。每轮筛选检测回收率和多克隆ELISA，以判断筛选是否有效；通过单克隆ELISA检测各克隆与叶酸受体α重组蛋白的结合能力；2)噬菌体阳性单克隆DNA的制备及测序鉴定：根据上述ELISA结果，选择阳性值高的噬菌体单克隆，对其进行扩增后进行测序模块的快速纯化以产生足够纯的模板进行测序，选用-96gIII测序引物送到公司进行测序，分析阳性噬菌体相应展示肽序列；3)细胞ELISA检测噬菌体克隆与天然细胞表面叶酸受体α的结合：选取FRα表达阳性细胞株SKOV3，并以FRα表达阴性细胞株HepG2为对照，通过ELISA检测噬菌体克隆与细胞株的结合；4)通过流式细胞术进一步确认噬菌体克隆与FRα表达阳性细胞株SKOV3的结合。有益效果本专利技术提供的FRα结合肽，可特异性结合FRα重组蛋白，同时通过细胞ELISA及流式细胞术实验分析，发现筛选出的噬菌体展示短肽能与细胞表面天然FRα特异性结合，具有潜在的医学和药学价值。附图说明：图1.多克隆ELISA；图2.阳性单克隆与叶酸受体α重组蛋白结合能力的研究。图2A.单克隆噬菌体ELISA筛选阳性克隆(圈出的克隆为叶酸受体α特异性结合肽3展示克隆)；图2B.阳性单克隆与叶酸受体α重组蛋白结合的进一步验证；图3.细胞ELISA检测筛选到的阳性单克隆与FRα表达阳性细胞SKOV3的结合，以M13以及FRα表达阴性细胞HepG2为对照；图4.流式细胞术实验分析阳性单克隆与SKOV3的特异性结合情况，对照组如图中虚线所示，仅加入抗M13抗体与FITC荧光抗体的SKOV3细胞。具体实施方式：为了更清楚地阐述本专利技术，下述内容提供了较为具体的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本专利技术并不仅仅限定于下述实施例。实施例1噬菌体展示肽库的亲和筛选随机十二肽噬菌体展示文库购自NEB公司，100μl，滴度为1.5×1013pfu/ml。贮存于含50％甘油的TBS缓冲液(50mMTris-HCl，150mMNaCl[PH7.5])中，库容量2.7×109个转化子。EscherichiacoilER2738是此肽库的宿主菌。(1)准备工作将FRα重组蛋白用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液[PH9.6])稀释至终浓度50μg/ml，稀释后的溶液以每孔100μl包被酶标板，并反复旋转直至表面完全湿润。在湿盒中4℃孵育过夜。(2)亲和筛选第二天倒掉酶标板中的包被液，用TBST缓冲液(TBS+体积比0.1％[v/v]Tween-20)洗板，倾去缓冲液，在干净的吸水纸上拍甩以除去残余的液体。之后在每孔中加入200μl封阻液(0.1MNaHCO3，5mg/mlBSA，0.02％NaN3[PH8.6])，置湿盒中4℃孵育过夜或是37℃孵育至少1小时。弃去封阻液，每孔加满TBST缓冲液，洗板6次，每次洗涤5分钟，置于脱色摇床上进行。再倾去缓冲液，在干净的吸水纸上拍甩以除去残余的液体，执行此实验步骤时要快速以避免孔板干燥。用TBST缓冲液稀释原始文库，取稀释后的文库液100μl加入到预先包被FRα重组蛋白的酶标板微孔内，加入的噬菌体数量约为5×1012。在湿盒中4℃孵育过夜或37℃放置2小时，弃去孔内液体，将酶标板倒置拍甩除去残余溶液，并用TBST缓冲液洗板10次，操作同前(洗去未结合的噬菌体)。最后一遍洗涤后，将孔内液体拍甩干净，向酶标板微孔中加入100μl非特异性缓冲液如0.2M甘氨酸-盐酸Glycine-HCl缓冲液[PH2.2]来洗脱已结合的噬菌体，于室温条件下，脱色摇床上温和摇动10分钟以充分洗脱，再用15μl1MTris-HCl[PH9.1]中和上述洗脱液，转移到一个干净的EP管中。按常规M13方法取5μl洗脱液用来测定洗脱物的滴度，剩余洗脱液均加入到20ml处于对数前期的ER2738菌种中进行第一轮噬菌体洗脱物的扩增，于37℃，220rpm摇床培养4.5小时，扩增产物转移到干净离心管中，经4℃，10,000rpm离心10分钟操作后，取约80％的噬菌体上清，转移到另一干净离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％[w/v]PEG-800，2.5MNaCl)，4℃放置至少1小时或过夜处理，进行噬菌体沉淀。4℃，10,000rpm离心10分钟，用微量移液器弃去残余上清，可再进行短暂离心以彻底吸弃上清。沉淀物重悬于200μlTBS缓冲液中，再次离心后取上清，转移到干净的离心管中，此即为扩增后的洗脱物。取5μl洗脱物进行噬菌体滴度的测定，其余部分用于第二轮亲和筛选。重复以上步骤共进行四轮筛选。逐轮筛选增加洗涤步骤中TBST的洗涤次数。(3)噬菌体滴度的测定接种ER2738菌种于10mlLB培养基中，37℃摇床培养至对数中期(OD600在0.5左右)。期间将上层琼脂于微波炉中加热溶解，分装到5ml灭菌EP管中，每管3ml，管数根据噬菌体稀释梯度而定，每个稀释梯度一管即可。分装的EP管置于45℃水浴锅备用；同时准备LB/IPTG/Xgal培养平板，置于37℃培养箱备用。对收集的噬菌体上清用LB培养基进行10倍梯度稀释(一般扩增的噬菌体稀释范围：108～1011)。稀释完成后将处于对数中期的ER2738菌液分装到若干个1.5ml灭菌EP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向叶酸受体α的多肽，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.1：Ser‑Gly‑Val‑Tyr‑Lys‑Val‑Ala‑Tyr‑Asp‑Trp‑Gln‑His。

【技术特征摘要】
1.一种靶向叶酸受体α的多肽，其特征在于氨基酸序列为SEQIDNO.1：Ser-Gly-Val-Tyr-Lys-Val-Ala-Tyr-Asp-Trp-Gln-His。2.一种靶向叶酸受体α的多肽，其特征在于为权利要求1所述多肽的衍生物，其衍生物包含但不限于乙酰化修饰物，脂肪酸链修饰物，PEG修饰物，多肽的基序两端分别连接有一个Cys，多肽首尾酰胺环。3.一种融合多肽或蛋白，其特征在于多肽或蛋白的N端或C端或中间包含权利要求1-2所述的多肽序列，其融合配体包含但不限于人血清白蛋白(HSA)、Fc片段、抗体或抗体片段、归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、体内逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子或它们的结合物和混合物。4.编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。5.一种核酸序列，其特征在于核酸分子的两端或中间包含权利要求4所述的核苷酸序列。6.一种药物组合物，其特征在于包...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旻，邱郑，邢黎军，徐祎凤，王红，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32