一种抗SARS病毒真菌的培养方法技术

一种抗ＳＡＲＳ病毒真菌的培养方法，其步骤顺序如下：　　　　（１）菌种选择：选用多孔菌（Ｐｏｌｙｐｏｒａｌｅｓ）中灰树花（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ）、灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　　ｌｕｃｉｄｕｍ）、桑黄（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ　　ｉｇｎｉｒｉｕｓ）、薄树灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｃａｐｅｎｓｅ）、香栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｕａｖｅｌｏｅｎｓ）之一，但不仅只限于此菌种；　　　　（２）斜面培养：将上述菌株接种于ｐＨ值调整为３～１２的固体斜面培养基上，１５～３０℃条件下培养菌体２～５天；　　　　（３）一级种子培养：将步骤（２）培养的菌株，无菌条件下用接种针取１～１０块每块大小为１ｃｍ↑［２］的斜面培养菌种块，加入每瓶装有１００～３００ｍｌ液体培养基的５００ｍＬ三角摇瓶内，ｐＨ值调整为３～１２，１５～３０℃条件下，在旋转摇床上培养，转速８０～２２０ｒ／ｍｉｎ，培养５～１０天，制得一级种子；　　　　（４）扩大培养：以体积比为液体培养基１／１０～１／２０的接种量，接一级种子于装有１０～２０Ｌ液体培养基的３０Ｌ种子罐内，ｐＨ值调整为３～１２，１５～３０℃条件下培养，搅拌速度为１２０～２２０ｒ／ｍｉｎ，通气量为１∶（０．２～１．５）ｖ／ｖ　　ｍｉｎ，罐压控制在０．２～０．５Ｋｇ／ｃｍ↑［２］，培养时间为３～１０天，制得二级种子；　　　　（５）发酵罐培养：以体积比为液体培养基１／１０～１／２０的接种量，接二级种子于装有２００～３００Ｌ液体培养基的５００Ｌ的发酵罐内，ｐＨ值调整为３～１２，１５～３０℃条件下培养，搅拌速度为１６０～２２０ｒ／ｍｉｎ，通气量为１∶（１．０～１．５）ｖ／ｖ　　ｍｉｎ，罐的压力控制在０．３～０．６Ｋｇ／ｃｍ↑［２］，培养时间为５～１０天，即得包括菌丝体与澄清液的多孔菌菌丝体液体培养悬浮液；　　　　（６）收集菌体：在５０００转／分条件下离心５～８分钟，收集步骤（５）制得的菌体，并用生理盐水洗涤２～３次；再将菌体置于２０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液中，调节ｐＨ至７～９，测定真菌菌株液体发酵生物量：菌球数量（个／１００ｍｌ），菌丝体鲜重（ｇ／１００ｍｌ），菌丝体干重（ｇ／１００ｍｌ）；　　　　上述所用固体斜面培养基或液体培养基配方是：１０００毫升蒸馏水中加入谷物类淀粉或玉米面或黄豆粉或马铃薯淀粉或麸皮５～３０克、酵母膏或酵母粉１～１０克、蛋白胨１～２０克、磷酸二氢钾０．１～２克、硫酸镁０．１～５克、葡萄糖或蔗糖１０～４０克；ｐＨ值调整为３～１２。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及食用真菌的培养方法，具体地说涉及一种具有抗SARS病毒作用的真菌——多孔菌(Polyporales)的培养方法。
技术介绍
关于抗SARS病毒作用的真菌——多孔菌(Polyporales)的培养方法，经检索到的相关专利有中国专利申请号为85103492裂褶菌的培养工艺及其利用，90102115微生物发酵生产多糖溶液，92102469食用菌与中草药混合发酵酿造新工艺，93102723含茯苓菌丝及其提取物的制剂及其制备方法，93104737食用菌与中草药混合发酵酿造的产品及其方法，94111624.7液体发酵生产鸡枞菌菌丝体的方法，99112556.8灰树花发酵液多糖提取方法，02136517.2灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法等专利，这些专利内容大多以常规方法进行菌体的培养、发酵以及进行其培养物的提取，其提取制备的活性物质主要用于抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等目的，但其提取物对于病毒抑制作用以及在动物及人体中抗病毒的疗效鲜有报道。近来，SARS病毒肆虐，对人有极强的传染性，给人民的生命财产造成严重损失，由于SARS病毒是一种冠状病毒变种，之前从未在人类或动物身上发现，是一种新发现的病毒，因此对它的性质、特点，哪个阶段病毒传染性最强，何种体液病毒含量最高，何种物质能够预防和抑制，何种药物能够治疗和控制等课题都成为现在研究的重点；其中在预防和抑制SARS病毒的药物开发中，利用改良和变换培养条件，对食用真菌——多孔菌(Polyporales)进行特化培养，使多孔菌产生抗SARS病毒活性物质的培养方法，经过文献和专利检索，国内外还未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种具有抗SARS病毒作用的真菌——多孔菌(Polyporales)的培养方法。该方法具有工艺简便、生长量大、成本低廉的特点，并且利用本专利技术培养的多孔菌所提取的粗提物对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。本专利技术的抗SARS病毒真菌的培养方法，其步骤顺序如下(1)菌种选择选用多孔菌(Polyporales)中灰树花(Grifola frondosa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、桑黄(Phellinus ignirius)、薄树灵芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)之一，但不仅只限于此菌种；(2)斜面培养将上述菌株接种于pH值调整为3～12的固体斜面培养基上，15～30℃条件下培养菌体2～5天；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下，用接种针取1～10块每块大小为1cm2的斜面培养菌种块，加入每瓶装有100～300ml液体培养基的500mL三角摇瓶内，pH值调整为3～12，15～30℃条件下，在旋转摇床上培养，转速80～220r/min，培养5～10天，制得一级种子；(4)扩大培养以体积比为液体培养基1/10～1/20的接种量，接一级种子于装有10～20L液体培养基的30L种子罐内，pH值调整为3～12，15～30℃条件下培养，搅拌速度为120～220r/min，通气量为1∶(0.2～1.5)v/v min，罐压控制在0.2～0.5Kg/cm2，培养时间为3～10天，制得二级种子；(5)发酵罐培养以体积比为液体培养基1/10～1/20的接种量，接二级种子于装有200～300L液体培养基的500L的发酵罐内，pH值调整为3～12，15～30℃条件下培养，搅拌速度为160～220r/min，通气量为1∶(1.0～1.5)v/v min，罐的压力控制在0.3～0.6Kg/cm2，培养时间为5～10天，即得包括菌丝体与澄清液的多孔菌菌丝体液体培养悬浮液；(6)收集菌体在5000转/分条件下离心5～8分钟，收集步骤(5)制得的菌体，并用生理盐水洗涤2～3次；再将菌体置于20～100mmol/L的磷酸钾缓冲液中，调节pH至7～9，测定真菌菌株液体发酵生物量菌球数量(个/100ml)，菌丝体鲜重(g/100ml)，菌丝体干重(g/100ml)；上述所用固体斜面培养基或液体培养基配方是1000毫升蒸馏水中加入谷物类淀粉或玉米面或黄豆粉或马铃薯淀粉或麸皮5～30克、酵母膏或酵母粉1～10克、蛋白胨1～20克、磷酸二氢钾0.1～2克、硫酸镁0.1～5克、葡萄糖或蔗糖10～40克；pH值调整为3～12。上述步骤(1)中所述的菌种选择灰树花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株、ATCC48141菌株、ATCC60301菌株、薄树灵芝(Ganoderma capense)ATCC76613菌株之一。上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是20～25℃。上述步骤(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间是6～8天。上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的pH值调整为4～10。上述步骤(3)中所述的旋转摇床培养其转速为130～200r/min。上述步骤(4)中所述的搅拌速度为150～200r/min。上述步骤(4)中所述的通气量为1∶(0.5～1.2)v/v min。上述步骤(4)、(5)中所述的罐压控制在0.3～0.5Kg/cm2。上述固体斜面培养基或液体培养基配方是1000毫升蒸馏水中加入玉米淀粉或玉米面或黄豆粉5～20克、酵母膏或酵母粉1～6克、蛋白胨1～10克、磷酸二氢钾0.1～2克、硫酸镁0.1～5克、葡萄糖或蔗糖10～25克；pH值调整为4～10。使用时，蒸汽压力控制在0.15Mpa条件下，高压灭菌20分钟。采用本专利技术的培养方法所具有的突出效果是1)通过二级制种，利用改良和变换培养条件，用合理的培养基配方，对食用真菌——多孔菌(Polyporales)进行特化培养，提高了种子的细胞密度，从而提高了单位体积的接种量，使菌体生长和强壮的发育得到了有利的保证，并且还避免了过长的培养时间，避免长时间培养可能带来的污染。2)利用本专利技术的方法具有工艺简便、生长量大、得率高、成本低廉的特点，并且，开创了高效而经济的食用真菌——多孔菌(Polyporales)的特化培养新技术，具备工业化生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。3)采用本专利技术的培养方法提取的多孔菌粗提物，经军事医学科学院微生物流行病研究所体外抗SARS病毒药物初筛试验，结果显示对SARS病毒具有完全的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。所作体外抗SARS病毒药物初筛试验的具体方法如下I、实验材料1、细胞VetoE6细胞(非洲绿猴肾细胞)2、病毒SARS病毒，BJ-01株3、培养液含10％胎牛血清的DMEM培养液II、实验条件生物安全三级实验室III、实验步骤1、CPE法测定病毒对VeroE6细胞半数毒性浓度(TCID50)2、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度3、药物的最大无毒浓度对SARS病毒的药效测定IV、实验结果1、病毒的TCID50为10-7。2、药物取5个浓度即1000、500、250、125和62.5ug/ml进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为125ug/ml。3、取125ug/ml药液，做4个复孔，观察对SAR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爱荣，隋方功，赵晨，田雪梅，
申请(专利权)人：莱阳农学院，
类型：发明
国别省市：