一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及人组织激肽释放酶的提取，是一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法。操作如下：（１）上清液分离；（２）层析：①台阶梯度洗脱：先用２０～３０ｍＭ、ｐＨ７～８的缓冲液平衡柱子，然后上清液泵入柱内；用内含０．１～０．２ＭＮａＣｌ的缓冲液洗脱，然后换内含０．３～０．５ＭＮａＣｌ的缓冲液，收集馏分，备用；先用１０～２０ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ５．０～６．０平衡柱子，然后台阶梯度洗脱收集馏分；接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为０．１ＭＮａＣｌ至０．５ＭＮａＣｌ，收集馏分保存；（３）亲和色谱分离纯化。其优点为：降低了操作成本，适于大规模生产应用；分离效果较好。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人组织激肽释放酶的提取，具体地说是。
技术介绍
1930年有人首次在尿及胰腺中发现一种具有特殊功能的蛋白质，并将其称为组织激肽释放酶(kallikrein)。以后在血浆及许多组织中也发现存在着激肽释放系统。此系统除参与炎症反应、致痛等作用外，还具有重要的内源性降压作用，与高血压、肾病等疾病的发病也有联系。上一世纪八十年代，国外就已经注意到kallikrein的多种生理功能，并对其进行了系统的研究。有关其基因位点、组织表达和生理功能等的研究已有诸多报道。kallikrein是一种丝氨酸蛋白酶，属于以丝氨酸残基为活性中心的丝蛋白酶家族下的一个亚类。kallikrein包括血浆kallikrein和组织kallikrein两种；正常情况下，绝大部分是以无活性的前体形式存在。组织kallkrein广泛存在于肾、胰腺、胃肠道粘膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽释放酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织kallkrein，并可释放至血液循环。在体内组织Kallikrein能特异性的裂解血浆激肽原I，生成活性产物胰激肽，并可进入血浆，经氨基肽酶水解生成缓激肽。激肽与其受体结合，可以产生血管扩张、离子运输、平滑肌松弛或收缩、细胞生长的激发与抑制等多种生物效应；因此kallikrein能够起到维持局部血压、稳定血管畅通、参与血液和电解质平衡等生理调节作用，对酶原的活化、生长因子的活化、激素前体的加工也起着重要的作用。近年来的动物实验结果表明kallikrein可大大减轻试验老鼠的心脏肥大，梗死尺寸和心脏细胞死亡及纤维化。对于患血管硬化病的试验老鼠，kallikrein可以降低气囊诱发的内皮损伤之后的心内膜损伤，其保护作用由β1和β2受体完成。Kallikrein还可以降低和避免药物或盐诱发的肾脏损伤，包括肾小管破裂、肾小球硬化症、蛋白质管状物聚积及发炎。kallikrein还能够降低盐敏感高血压老鼠的撞击死亡率，对于后肢局部缺血的试验老鼠可加快其血流速度，由此可见kallikrein对于高血压、心脏疾病、肾脏疾病等皆有潜在的疗效。直接进行人体的kallikrein的分离纯化难度较大，四川大学华西医学中心的王正荣等人在基因工程技术生产动物激肽释放酶及其应用方面作过一些有益的工作。美国南卡大学医学院Chao最先采用生物工程的方法将从胎儿肾细胞中得到的人组织kallikrein基因进行克隆，并构建出载有kallikrein基因的重组病毒。2000年深圳市人民医院李体远等人采用类似的方法在国内率先成功克隆出人kallikrein基因，经上海Sangon生物工程公司测序分析，这种新克隆的中国人体组织kallikrein基因与国际报道的基因序列完全一致。最近，武汉大学的研究者将载有人kallikrein基因的重组病毒注射到高血压大鼠的静脉中，可以使大鼠的血压降低到正常水平并保持长时间平稳。为了克服病毒在体内表达的弊端，Chao等采用昆虫细胞系进行表达。这种方法得到的人kallikrein相对安全、可靠，是实现基因工程人组织kallikrein规模化生产的可行方向。目前实验使用的kallikrein一般采用从人尿液中提取的方法得到，作为药物应用的kallikrein产品几乎全部来源于从动物胰脏提取。从人尿中提取激肽释放酶必须先经过富集处理，并进一步通过膜色谱等方法进行分离纯化。由于kallikrein在活体组织及体液中含量极少，在1000L尿中最多只能提取得到17mgkallikrein，制备成本极高。从动物组织中提取kallkrein，首先采用组织破碎，进一步采用盐析、色谱分离等方法进行纯化。由于动物激肽释放酶与人激肽释放酶在结构上的差异，糖基化程度不同，因此不同来源的样品，由于其本底组成的差别，分离纯化方法也不尽相同。其不足之处在于盐析、色谱分离是在多步骤操作下完成，十分繁顼，且多步操作损失较大，不适于大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单、适于大规模生产的基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为本专利技术的分离纯化方法包括离心、离子交换层析、亲和层析等步骤，具体过程为(1)细胞培养上清液的分离将含有人组织激肽释放酶的培养液离心分离，取上清液备用；(2)离子交换层析分离①首先采用台阶梯度洗脱，以尽可能多地回收培养基中的人组织激肽释放酶；具体为用20～30mM、pH7～8的缓冲液平衡柱子，然后将上清液泵入柱内；用20～30mM pH7～8内含0.1～0.2MNaCl的缓冲液洗脱，待检测值低于0.05以下后换20～30mM pH7～8内含0.3～0.5M NaCl的缓冲液，人组织激肽释放酶此时解吸附，从柱内流出，收集此时的馏分，4℃贮存备用；柱子再生备用；其中缓冲液可以为Tris-HCl、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等；NaCl也可以用KCl替代；②采用台阶梯度与线性梯度相结合的方法，尽可能将人组织激肽释放酶与其它杂蛋白分离开；样品预处理所述步骤①中离子交换柱收集的馏分超滤(采用Centriprep10P)截留分子量为10Kda以上的滤器浓缩样品，然后将浓缩后样品重新溶解在10～20mM NaAc pH5.0～6.0的缓冲液中；样品分离先用10～20mM NaAc pH5.0～6.0平衡柱子，然后将处理好的样品载入柱内，用平衡缓冲液继续冲柱，直到A280吸收值降至0.05以下，再用10～20mM NaAcpH5.0～6.0内含0.05～0.1M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分a；然后用10～20mM NaAc pH5.0～6.0内含0.1～0.15M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分b，接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为0.1M NaCl至0.5M NaCl，将大量人组织激肽释放酶洗脱下来，收集馏分，4℃保存；在所述馏分a和b中也有少量人组织激肽释放酶洗脱下来，可收集起来重新过柱；NaCl也可以用KCL替代；离子交换层析分离过程中所使用的离子交换剂可以为DEAE-cellulose、DEAE-sephadex或DEAE-spharose等多糖类离子交换剂，也可以采用DEAESepharose CL-6B等交联的琼脂糖类离子交换树脂。一般来讲，弱阴离子交换树脂皆可以用于这一步分离；(3)亲和色谱分离纯化按常规方法操作，得产品。人组织激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，可用特异性免疫亲和、苯甲酸胺(PAB)、抑肽酶(Aprotinin)等多种亲和色谱分离介质进行纯化。Aprotinin-Agrose柱纯化方法a将活性馏分适当浓缩(超滤)后，转移至亲和柱上，用15-25mM Tris-HCl，pH6.5～7.5缓冲液充分洗涤；除去未吸附的蛋白质，至A280吸收值降至基线；然后用0.05～0.15mol/L GIy-HCI，pH2.0～3.0缓冲液洗脱；出现的洗脱峰即为目标产物；立即用0.3～0.5mol/L Tris中和；将中和后溶液对20～25mM磷酸缓冲液透析；冷冻干燥。Aprotinin-Agrose柱纯化方法b先用15～25mM Tris-HCl、pH7.5～8.5内含200～250mM NaCl的缓冲液平衡柱子，将样品载入柱内，用0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法，其特征在于具体过程操作如下：　　　　（１）细胞培养上清液的分离：将含有人组织激肽释放酶的培养液离心分离，取上清液备用；　　　　（２）离子交换层析分离：　　　　①采用台阶梯度洗脱：先用２０～３０ｍＭ、ｐＨ７～８的缓冲液平衡柱子，然后将上清液泵入柱内；再用２０～３０ｍＭ、ｐＨ７～８内含０．１～０．２Ｍ　　ＮａＣｌ的缓冲液洗脱，然后换２０～３０ｍＭ　　ｐＨ７～８内含０．２～０．４Ｍ　　ＮａＣｌ的缓冲液，收集此时的馏分，备用；　　　　②先用１０～２０ｍＭ　　ＮａＡｃ、ｐＨ５．０～６．０平衡柱子，然后将样品载入柱内，用平衡缓冲液继续冲柱，再用１０～２０ｍＭ　　ＮａＡｃ、ｐＨ５．０～６．０内含０．０５～０．１Ｍ　　ＮａＣｌ的缓冲液洗脱，收集馏分ａ；然后用１０～２０ｍＭ　　ＮａＡｃ、ｐＨ５．０～６．０内含０．１～０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ的缓冲液洗脱，收集馏分ｂ；接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为０．１Ｍ　　ＮａＣｌ至０．５Ｍ　　ＮａＣｌ，收集馏分保存；　　　　（３）亲和色谱分离纯化：按常规方法操作，得产品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉奎，张维冰，杨青，徐茂兰，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]