甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法技术

本发明专利技术提供一种甲型肝炎灭活疫苗吕８快株的选育和制备方法，它将吕８株病毒液按１∶５－５０的体积比接种在致密细胞单层上，置３７℃吸附２小时，补充ｐＨ７．４－７．８的维持液，３５－３６℃培养传代，１－２代次每代培养３５天，３－６代次每代培养２８天，７－２６代次每代培养１２－１６天，收获毒株。该毒株的抗原滴度和感染性滴度较高，经狨猴毒力实验证明已由强毒株变异为弱毒株，用它生产甲肝灭活疫苗不仅对人体安全，有良好的免疫原性和保护效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由３５天缩短为１２－１６天，因此，有利于进行大规模的产业化生产，因此，是一种生产甲肝灭活疫苗的理想毒株。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含有病毒抗原的医用生物制品，尤其是一种用于预防人类甲型肝炎的灭活疫苗毒株及其制备方法。甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的一种自限性病毒性传染病，世界各地均有此病的发生。在不发达或发展中国家卫生条件差的地区最容易传播成为高度地方性的流行病，而在高流行区易感染者主要是儿童。我国是HAV感染的高流行区，平均每年有24万人患甲型肝炎，为此，许多研究者致力于甲型肝炎疫苗的研究。如美国专利4.164.566公开了一种在人类灵长目动物(如狨猴)细胞培养中选育出HAV制备甲型肝炎疫苗。美国专利4.506.016公开了一种将甲肝病毒首先适宜于人肾细胞，然后再适应于人胚肺细胞的减毒HAV株制备甲肝减毒活疫苗。中国专利891065806公开了甲型肝炎减毒疫苗毒种(H2减毒株)及其制备方法。中国专利921149980公开了甲型肝炎疫苗的生产方法，提供了制备甲型肝炎疫苗的毒种LA-1减毒株及规模化生产疫苗的方法。因此，加大研制甲型肝炎疫苗的进度和力度已成为刻不容缓的任务。本专利技术的目的在于提供一种安全、有效，繁殖周期短，适于大规模生产甲肝灭活疫苗的毒株。本专利技术通过下列技术方案实现所采用的甲型肝炎灭活疫苗毒株是从甲肝患者粪便中直接用人胚肺二倍体细胞(KMB17株)培养、分离而获得的吕8株病毒毒种，经过将人胚肺二倍体细胞37℃培养4-5天形成致密细胞单层，用PBS洗涤细胞，其特征在于将吕8株病毒液按1∶5-50的体积比接种在致密细胞单层上，置37℃吸附2小时，补充pH7.4-7.8的维持液，35-36℃培养传代，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，7-26代次每代培养12-16天，收获毒株。本专利技术所用毒种-吕8株是在1988年我国上海地区流行甲肝时，从典型甲肝急性期患者粪便中分离的甲型肝炎病毒，经KMB17人胚肺二倍体细胞培养、分离、适应得到的毒种。本专利技术所述毒株培养过程中，1-6代次每周更换维持液一次，维持液中含5-10％的小牛血清和卡那霉素80-100u/ml，7-26代次则不需要更换维持液。用本专利技术方法制备的甲肝灭活疫苗毒株-吕8快株，其抗原滴度和感染性滴度较高，经狨猴毒力实验证明已由强毒株变异为弱毒株，用它生产甲肝灭活疫苗不仅对人体安全，有良好的免疫原性和保护效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由35天缩短为12-16天，因此，有利于进行大规模的产业化生产，因此，是一种生产甲肝灭活疫苗的理想毒株。本专利技术提供的甲型肝炎灭活疫苗毒株25代和26代经中国药品生物制品检定所进行检定，其结果见下表 本专利技术提供的甲型肝炎灭活疫苗毒株-吕8快株的性质如下形状球形，27-30mm；氯化铯浮密度1.34g/cm2；耐热性60℃30分钟对感染性无明显影响，100℃5分钟可完全灭活；抗原滴度1∶512～1∶1024；感染性滴度107.5～108.5CCID50/ml；繁殖高峰时间12-16天；最适繁殖温度35-36℃；繁殖部位细胞胞浆内；致细胞病变未见CPE；毒力未见血清酶的异常升高，肝脏组织未见病理变化；免疫原性可使小白鼠、恒河猴、狨猴产生较强的免疫反应。实施例1按常规方法先将人胚肺二倍体细胞(KMB17株)置于37℃培养4-5天，使之长成致密细胞单层，弃旧液，用PBS洗涤细胞一次，按1∶5的体积比接种吕8株病毒，置37℃吸附2小时，补充pH7.4维持液，其中维持液中含5-10％小牛血清和80-100u/ml卡那霉素，置35℃继续培养，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，每周更换维持液一次，7-26代次每代培养12天，收获，收毒时用PBS洗涤细胞一次，加消化液，让消化液过细胞面三次，当细胞从瓶壁脱落后，按20μl/cm2的量加入无酚红PBS或MEM制成悬浮液，收集悬浮液于PP瓶中，用大容量低速离心机在4℃2000～2500rpm离心15-20分钟，用PBS或生理盐水(0.85％NaCL)悬浮细胞沉淀，收集细胞悬液装瓶，置-30℃冷藏，得吕8快株病毒液。实施例2除接种吕8株病毒比例为1∶50，7-26代次每代培养16天，收获毒株外，其余制备工艺过程均与实施例1相同。实施例3除接种吕8株病毒比例为1∶25，7-26代次每代培养14天，收获毒株外，其余制备工艺过程均与实施例1相同。动物接种试验试验组将本专利技术之主种子批(25代)静脉接种普通狨猴2只，接种剂量为7.44CCID50/ml，观察12周。接种后两周抗体阳转，血清酶无异常升高，肝脏组织未见病理变化。对照组将吕8粪便悬液接种2只狨猴，接种剂量为1.23CCID50/ml，接种后ALT有1-2周次升高，AST有3-4周次升高，肝脏出现+++的病理变化。说明吕8株经组织培养，快速传代后，根据血清肝酶变化以及肝脏病理检查结果，其毒力基本属于弱毒性质，且抗原性仍然保持良好。权利要求1.一种，它包括从甲肝患者粪便中直接用人胚肺二倍体细胞(KMB17株)培养、分离而获得的吕8株病毒毒种，以及将人胚肺二倍体细胞置于37℃培养4-5天形成致密细胞单层，用PBS洗涤细胞，其特征在于将吕8株病毒液按1∶5-50的体积比接种在致密细胞单层上，置37℃吸附2小时，补充pH7.4-7.8的维持液，35-36℃培养传代，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，7-26代次每代培养12-16天，收获毒株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述毒株培养过程中，1-6代次每周更换维持液一次，维持液中含5-10％的小牛血清和80-100u/ml的卡那霉素。全文摘要本专利技术提供一种，它将吕8株病毒液按1∶5－50的体积比接种在致密细胞单层上，置37℃吸附2小时，补充pH7.4－7.8的维持液，35－36℃培养传代，1－2代次每代培养35天，3－6代次每代培养28天，7－26代次每代培养12－16天，收获毒株。该毒株的抗原滴度和感染性滴度较高，经狨猴毒力实验证明已由强毒株变异为弱毒株，用它生产甲肝灭活疫苗不仅对人体安全，有良好的免疫原性和保护效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由35天缩短为12－16天，因此，有利于进行大规模的产业化生产，因此，是一种生产甲肝灭活疫苗的理想毒株。文档编号C12N7/04GK1490053SQ0213392公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月17日 优先权日2002年10月17日专利技术者陈统球, 褚嘉祐, 张华远, 万宗举, 侯宗柳, 阳选祥, 谭顺革, 曹逸云, 金炜翔, 龙润乡, 李华, 杨净思 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲型肝炎灭活疫苗吕８快株的选育和制备方法，它包括从甲肝患者粪便中直接用人胚肺二倍体细胞（ＫＭＢ１７株）培养、分离而获得的吕８株病毒毒种，以及将人胚肺二倍体细胞置于３７℃培养４－５天形成致密细胞单层，用ＰＢＳ洗涤细胞，其特征在于：将吕８株病毒液按１∶５－５０的体积比接种在致密细胞单层上，置３７℃吸附２小时，补充ｐＨ７．４－７．８的维持液，３５－３６℃培养传代，１－２代次每代培养３５天，３－６代次每代培养２８天，７－２６代次每代培养１２－１６天，收获毒株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈统球，褚嘉祐，张华远，万宗举，侯宗柳，阳选祥，谭顺革，曹逸云，金炜翔，龙润乡，李华，杨净思，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]