脂酶变体制造技术

将肽的延伸物与脂酶Ｃ－末端氨基酸相连可以降低形成气味的趋势。所产生的脂酶变体在洗涤由包含相对短链脂酰基团（例如高达Ｃ８）的脂，例如包含乳脂肪或诸如椰子油和棕榈仁油的热带油的乳品污物污染的织物时，可减少气味生成。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及减少气味产生潜能的脂酶变体和制备它们的方法。本专利技术尤其涉及适合用于洗涤剂组合物的变体，尤其是Thermomyces lanuginosus脂酶的变体，其在清洗乳脂污染的织物时显示首洗(first-wash)效果和降低气味形成的倾向。
技术介绍
脂酶可用作例如洗涤剂酶以除去衣服和其它纺织品上的脂或脂肪污物，还可用作面包和其它烘焙产品的生面团的添加剂。因此，以商品名Lipolase(Novo Nordisk A/S的产品)出售的源于Thermomyceslanuginosus(与Humicola lanuginosa同义，EP 258 068和EP 305 216)的脂酶用作洗涤剂。WO 0060063描述了T.lanuginosus脂酶的变体，其在洗涤剂溶液中具有尤其好的首洗性能。WO 9704079，WO 9707202和WO0032758还公开了T.lanuginosus脂酶的变体。在某些应用中，最小化产生气味的短链脂肪酸的形成是非常重要的。已知具有脂酶的洗涤剂有时可以遗留下残余气味附着于乳污染的衣物(EP430315)。
技术实现思路
专利技术人已经发现将肽的延伸物连接到脂肪酶C-末端氨基酸可以减小形成气味的倾向。在洗涤包含相对短链酯酰基团(例如高达C8)的脂污染例如乳品污染(所述乳品包含乳脂或诸如椰子油和棕榈仁油的热带油)的织物时，可导致具有减少气味生成的脂酶变体。该变体对长链酰基基团的特异性比对短链酰基基团的特异性提高了，和/或升高了在碱性pH与中性pH时的活性比，即在冲洗期间的中性pH(约pH 7)时的脂酶活性低于在类似于洗涤液的pH的碱性pH(例如pH 9或10)时的脂酶活性。因此，本专利技术提供一种制备脂酶的方法，是通过将肽延伸物附着在亲代脂酶的C-末端并筛选所得的肽来找到具有任何上述改进特性的脂酶。本专利技术还提供一种具有脂酶活性和氨基酸序列的多肽，其包括具有脂酶活性的亲代多肽和附着在亲代多肽的C-末端的肽的延伸物。本专利技术还提供一种洗涤剂组合物和使用具有上述特性的脂酶制备洗涤剂的方法。专利技术详述亲代脂酶亲代脂酶可以是氨基酸序列与SEQ ID NO2所示的T.lanuginosus脂酶的序列具有至少50％同一性的真菌脂酶。因此，亲代脂酶可以是通过使用基于此说明书中的DNA序列所设计的探针，从踝节菌属(Talaromyces)菌株或者Thermomyces菌株，尤其是Talaromyces thermophilus，Thermomyces ibadanensis，Talaromycesemersonii或者Talaromyces byssochlamydoides得来的。更具体的是，亲代脂酶可以是自下面所示的生物体分离出的脂酶，具有所示的氨基酸序列。根据布达佩斯条约保藏于DSMZ的含有该基因的大肠杆菌菌株如下 根据贸易条款上述来源的生物体可以容易地得到。菌株在下面地址保藏DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH)，MascheroderWeg 1b，D-38124Braunschweig DE。ATCC(美国典型培养物保藏中心American Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。CBS(荷兰真菌菌种保藏中心Centraalbureau voorSchimmelcultures)，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，The Netherlands。UAMH(加拿大阿尔伯达大学植物霉菌培养物保藏中心University ofAlberta Mold Herbarium & Culture Collection)，Devonian BotanicGarden，Edmonton，Alberta，Canada T6G 3GI. 或者，亲代脂酶可以是通过改变上述任何脂酶的氨基酸序列获得的变体，尤其是WO 0060063中所述的或下面所述的具有首洗活性的变体。C-末端的肽延伸物本专利技术通过肽键将添加的肽附着到亲代脂酶的C-末端氨基酸(例如SEQ ID NO2所示的T lanuginosus脂酶的L269)。肽的延伸物可以通过定点突变或随机突变实现附着。在C-末端的肽的延伸物可以由2-15个氨基酸残基，尤其是2-11或3-10例如2，3，4，5，7，9或11个氨基酸残基组成。延伸物尤其可以具有在所示的位置的以下残基(从C-末端起始计数)·在第一位置的带负电荷的氨基酸(negative amino acid)残基(例如D或E)，·在第二和/或第三位置的小的不带电荷的氨基酸(例如S，T，V或L)，和/或·在第3到第7尤其是第4，5或6位置的带正电荷的氨基酸(positiveamino acid)残基(例如H或K)。肽的延伸物可以是HTPSSGRGGHR或其截短形式，例如HTPSSGRGG，HTPSSGR，HTPSS或HTP。其它的实例为KV，EST，LVY，RHT，SVF，SVT，TAD，TPA，AGVF和PGLPFKRV。肽的延伸物可以通过使用编码亲代多肽的载体(质粒)和相应于C-末端的2-15个氨基酸延伸物的具有终止密码子的寡核苷酸得以附着。在C-末端和终止密码子之间的核苷酸可以是随机的或可以是偏好上述氨基酸的。一种实施方式是设计寡DNA(DNA oligo)，其包含所需的随机突变以及具有与目的基因3′端杂交所必需的序列。该寡DNA在PCR反应中与具有能与互补DNA链(本领域技术人员已知的)杂交的寡核苷酸(oligo)一起使用，然后将PCR片段克隆入目的物(表达载体)。提高对长链/短链的特异性与亲代脂酶相比，本专利技术的脂酶提高了对长链/短链的特异性，例如提高了对长链(例如C16-C20)甘油三酸酯的活性/对短链(例如C4-C8)甘油三酸酯的活性的比值。这可以通过以橄榄油作底物的SLU的比值和以三丁酸甘油酯为底物的LU的比值测定(方法在说明书后面描述)。提高碱性pH活性/中性pH活性的比值与亲代脂酶相比，本专利技术的脂酶提高了碱性pH活性/中性pH活性的比值，即升高了在碱性pH(例如pH 9-10)和在中性pH(约pH 7)情况下的脂酶活性的比值。这可以用后面说明书描述的以三丁酸甘油酯为底物的方法进行测定。用带正电荷的氨基酸进行取代亲代脂酶可以在接近相应于SEQ ID NO2的E1或Q249的位置包括一个或多个(例如2-4个，尤其是2个)用带正电荷的氨基酸取代中性或带负电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸可以是K，R或H，尤其是R。负的和中性氨基酸可以是其它任何氨基酸。取代可以在距离SEQ ID NO2的E1或Q249 15内的三维结构表面进行，例如相应于1-11，90，95，169，171-175，192-211，213-226，228-258或260-262的任何一位置。取代可以在E1或Q249的10内，例如相应于1-7，10，175，195，197-202，204-206，209，215，219-224，230本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备具有脂酶活性的多肽的方法，包括：　　　　ａ）制备至少一种具有氨基酸序列的多肽，包括：　　　　　ｉ）具有脂酶活性的亲代多肽和　　　　ｉｉ）附着在亲代多肽Ｃ－末端的多肽的延伸物　　　　ｂ）选择具有脂酶活性的多肽，与亲代多肽相比该多肽具有：　　　　ｉ）对于短链和长链脂肪酰酯的活性之比较低，　　　　ｉｉ）中性和碱性ｐＨ情况下的脂酶活性之比较低，和／或　　　　ｉｉｉ）在具有该多肽的洗涤剂中洗涤有脂污物的织物样品时形成气味的倾向降低，　　　　ｃ）产生所选的多肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：西格尼芒克，杰斯珀文德，金博尔奇，沙姆坎特A帕特卡，桑尼OS格拉德，阿伦斯文德森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]