用于癌症基因治疗的靶向载体构建和用途制造技术

本发明专利技术涉及核酸序列，含有它们的载体，及其用于端粒酶阳性肿瘤的基因治疗用途。更具体地讲，本发明专利技术涉及含有人端粒酶催化亚基基因启动子基因的核酸序列的载体构建，以及它们的基因治疗应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学专业领域，涉及含有人端粒酶催化亚基基因启动子基因部分核酸序列作为基因表达调控序列的载体构建，以及用于端粒酶阳性肿瘤细胞的基因治疗的用途。癌症的基因治疗一直是分子生物学研究的热点，但是基因治疗并不如当初人们想象的那样完美。基因治疗关键中的首要问题是基因治疗的靶向性问题，即在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其它正常细胞。这对于基因治疗，尤其是恶性肿瘤的治疗尤为重要。利用特异性的基因启动子限制目的基因只在靶细胞中表达是靶向基因治疗的一种有效的治疗途径。研究表明85％以上的肿瘤细胞和永生化的细胞具有高度的端粒酶活性。人端粒酶的主要成分有端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(hTP)、端粒酶催化亚基蛋白(hTERT)。hTR和hTP在人端粒酶活性阴性的正常组织中广泛表达，hTERT只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达，正常组织中的hTERT表达被抑制。因此，认为hTERT是人端粒酶复合物的核心成分，其基因的表达状态是细胞调控端粒酶活性的主要环节。这些结果表明hTERT启动子将在肿瘤基因治疗中具有广泛作用。通过对hTERT启动子序列分析表明在启动子区，一个最显著的特点是GC含量高，无典型的TATA和CAAT盒。在hTERT启动子核心区域存在许多潜在的转录因子结合位点。其中5个Sp1结合位点和2个E盒对hTERT的转录活性至关重要，每个位点发生突变都将导致不同程度的转录活性降低。当5个Sp1位点被同时突变，则可使核心启动子的转录活性下降90％以上。Sp1结合位点和E盒对hTERT的转录活性具有协同作用。5’GACCCCCGGGTCCGCCCGGAGCAGCTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGC 3’端粒酶催化亚基基因启动子部分DNA序列式我们利用端粒酶催化亚基(hTERT)启动子在大部分肿瘤细胞中表达的特点，克隆了含有5个Sp1结合位点和2个E盒的319bp的hTERT启动子核心序列，成功构建了hTERT启动子调控的荧光素酶报告载体，并转染肿瘤细胞和正常细胞。结果表明，319bp的hTERT启动子核心片段在端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性，而在端粒酶阴性的正常细胞中则无转录活性。提示由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的靶向性基因治疗载体。为了在肿瘤细胞中诱导凋亡，许多研究者都将焦点集中在一些直接诱导凋亡的基因上，它们的过量表达均可诱发细胞凋亡。其中尤以caspase-3最引人注目。为此，我们选择caspase-3作为效应基因。构建了端粒酶催化亚基(hTERT)启动子调控caspase3基因的真核表达载体，结果表明hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2中明显表达，而在正常人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HEL)中未见表达；caspase3表达能明显对端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的增殖产生明显抑制作用，表明hTERT启动子调控的caspase-3基因表达载体是一种有应用潜力的肿瘤基因治疗载体。抑瘤素(osm)是一种28KD的细胞因子，其前体由252个氨基酸残基组成，N端有25个氨基的信号肽，C端有类似的胰蛋白酶位点，能切除31个氨基酸残基，形成196个氨基酸的OSM，其抑制因子活性提高5-60倍。OSM的受体分布广泛，生物活性多样，可抑制多种肿瘤细胞系的生长。为此，我们将抑瘤素基因连接到构建好的带有端粒酶启动子序列的真核细胞表达载体中，研究端粒酶启动子在肿瘤细胞中特异表达抑瘤素对肿瘤细胞生长的影响。结果表明hTERT启动子调控的抑瘤素基因对转染的四种肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的生长均有不同程度的抑制作用。而对端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞的生长没有明显的抑制作用。这表明端粒酶启动子可以调控osm外源基因仅在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，并能减少Osm对正常细胞的毒性。mda-7(melanoma differentiation-associated gene-7)是在黑色素瘤细胞中首次克隆的基因，随着癌细胞的发育，mda-7的表达减少，并最终消失。mda-7能引起癌细胞的凋亡，而在正常细胞中却无此作用。此外，mda-7表达还有刺激免疫系统的作用。因此，mda-7是肿瘤基因治疗中采用的重要基因。apoptin即鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白，由121个氨基酸组成，apoptin作为一种转录调节物发挥调控作用。研究发现apoptin蛋白能选择性诱导肿瘤细胞凋亡，且不依赖于p53的介导，不被Bcl-2过表达所抑制，不易产生抗药性，可能成为一种非常有前景的抗肿瘤治疗剂。Apoptin被认为是真正意义上的第一个被发现的可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。因此，我们也将mda-7和apoptin作为连接在端粒酶启动子序列下游的对癌细胞生长具有抑制或杀伤作用的基因用于肿瘤的基因治疗。本文构建了hTERT启动子调控的端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达的载体，并对其在肿瘤细胞中特异调控表达抑瘤素基因和caspase-3基因对端粒酶阳性肿瘤细胞的生长抑制作用进行了研究。结果表明含有人端粒酶催化亚基基因启动子基因部分核酸序列作为基因表达调控序列的载体可以用于端粒酶阳性肿瘤细胞的基因治疗的用途。本专利技术用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本专利技术。以下为结合附图进一步说明本专利技术附图说明图1.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的肿瘤靶向性基因治疗载体构建图2.人端粒酶催化亚基hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性图3.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的osm基因表达载体构建图4.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的osm基因表达在体外抑癌作用图5.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的caspase-3基因表达载体构建图6.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的caspase-3基因表达在体外抑癌作用图7.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的caspase-3基因表达在体外诱导细胞凋亡实施例一人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的肿瘤靶向性基因治疗载体以本实验室保存的含有端粒酶催化亚基启动子DNA序列的质粒pcDNA3-hTERT/promoter为模板，设计寡核苷酸引物(引物15′-TAGAGCTCGACCCCCGGGTCCGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
以人端粒酶催化亚基基因启动子基因部分核酸序列（见ＤＮＡ序列式）作为基因表达调控序列，构建真核细胞表达载体。５’ＧＡＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡ ＴＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＣ ＣＧＴＣＣＣＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴ ＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣ３’ＤＮＡ序列式序列式中Ａ为腺嘌呤核苷酸；Ｃ为胞嘧啶核苷酸；Ｇ为鸟嘌呤核苷酸；Ｔ为胸腺嘧啶核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓飞，杨义军，朱捷，孙志贤，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]