人干扰素与无裂解性的人lgGFc变体的融合蛋白及制备制造技术

本发明专利技术属生物医药技术领域。本发明专利技术公开了一种人干扰素（ＨｕＩＦＮ）与缺乏裂解性的人ＩｇＧ　　Ｆｃ变体（ｖＦｃ）的融合蛋白。该融合蛋白具有与重组人干扰素相似高度的生物活性。含有人ＩＦＮ、约２０个或更少氨基酸的柔性肽接头、和人ＩｇＧ　Ｆｃ变体。这种Ｆｃ变体无裂解性，且显示极小的不良Ｆｃ－介导的副作用。本发明专利技术公开了一种高表达水平制备或产生这类融合蛋白的方法。本发明专利技术的ＨｕＩＦＮ－Ｌ－ｖＦｃ融合蛋白表现出更长的血清半衰期和极高的生物活性，从而改善药物动力学和药效，能降低患者使用时的注射频率。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物医药
具体涉及一种人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白及制备。
技术介绍
干扰素(IFN)是一类人体内产生的蛋白，具有抵抗病毒，阻止细胞增殖以及调节免疫反应等生物活性。基于生理化学和生物的差异，共有三种干扰素IFN-alpha(IFNα)、IFN-beta(IFNβ)、和IFN-gamma(IFNγ)。其中IFNα和IFNβ统称为第一类型干扰素。第一类型干扰素靶向有反应的细胞表面上的干扰素α/β受体。与IFN结合后，被激活的受体会引起酪氨酸磷酸化。然后，发生一系列的信号转导而刺激某些基因的转录，导致特异蛋白的合成。这些由干扰素促进的蛋白常具有干扰素的生物活性(参见，如Stark等人，Annu.Rev.Biochem.，67227-264，1998)。许多这类由干扰素促生的蛋白，如2-5 OAS，neopterin，和Mx蛋白等，都是免疫反应中极为重要的媒介。重组人干扰素-α(rHuIFNα)，包括重组干扰素-α2a(rHuIFNα2a)和干扰素-α2b(rHuIFNα2b)，在许多国家已广泛用于治疗B型肝炎、C型肝炎、与某些癌症，包括阴道瘤、多毛细胞白血病、慢性骨髓细胞白血病、黑色素瘤以及爱滋病引发的卡波西肉瘤。重组人干扰素-β(rHuIFNβ)在欧美国家已用于治疗多发性硬化症。IFNβ在临床试验中用于治疗癌症和某些病毒引起的病症。正如同其他的细胞激素经注射入人体后，干扰素的血清清除半衰期很短。因为人体内天然的干扰素只在局部产生，效用期间也短，rHuIFNα和rHuIFNβ的血清清除半衰期都只有数小时(参见，如Physician′s Desk Reference)。为了要达到相当的药效，必须要经常注射高剂量的IFN。因此治疗之中常有不良的副作用。包括显示在神经，内分泌和免疫系统的毒性。针对这些rHuIFN的缺点，我们意欲发展改良的产品，来延长血清半衰期，并保持其生物活性，从而增加药效。已有报道说将聚乙二醇(PEG)连接于各种蛋白质(包括IFN)能得到因半衰期长而在体内效力较高的衍生物(参见，如Baker，Rev.Gastroenterol.Disord.，187-99，2001；Zalipsky等人，“PEG化学；生物技术和生物医药的应用”，第347-370页，1992)。通常PEG缀合的蛋白质比它们未经修饰的亲代蛋白质的体外生物活性低(参见，如Eliason等人，Stem Cells，1840-45，2000)。而这些经修饰的蛋白质体内效力的增加至少部分是因为按其分子量的增加而降低了肾的清除作用(参见，如Yamaoda等人，J.Pharmaceut.Sci.，83601-606，1994)。IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报道说将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，如Capon等人，Nature，337525-531，1989；Chamow等人，Trends Biotechnol.，1452-60，1996；美国专利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgGFc绞链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白质，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。这种方法已用于一些临床上很重要的细胞因子(如IL-2，IFNβ，IFN-α2a和IFN-α2b)和可溶性受体(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(参见，如美国专利No.5,349,053，5,723,125，5,908,626和6,224,867)。已有人报道了促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)。与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域(相隔3到7氨基酸肽接头)的融合蛋白表现出减弱的活性(参见，如Qiu等人，J.Biol.Chem.，27311173-11176，1998)。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子表现出提高相当多的体外和体内的活性(参见，如Sytkowski等人，J.Biol.Chem.，27424773-24778，1999；美国专利No.6,187,564)。两个EPO分子间的肽接头的长度非常重要，可能是因为其对这些分子结构的柔韧性的影响，但也不限于这个解释。在大部分已报道的Fc融合蛋白分子中，绞链区作为Fc区域(在羧基端)与细胞因子或可溶性受体(在氨基端)间的间隔，使这分子的这两部分能分别行使功能(参见，如Ashkenazi等人，Current Opinionin Immunology，9195-200，1997)。在人IFN和人IgGFc间添加的柔性肽接头可能以两种方式提高HuIFN-L-Fc的体外生物活性(1)保持Fc区域与IFN上IFN受体结合位点的距离，和(2)保持一个IFN和另一个IFN区域的距离，从而使IFN区域能分别与细胞表面上的IFN受体反应。人免疫球蛋白的Fc区域在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导而通过两种主要机制(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)的结合，导致通过依赖抗体的细胞毒性(ADCC)途径，通过吞噬作用或裂解作用而摄食病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3能有效地结合FcγR。IgG4与FcγR的结合亲和力比IgG1或IgG3的低一个数量级，而IgG2与FcγR的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效地结合C1q，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4似乎在激活补体级联反应的能力方面很有缺陷(参见，如Jefferis等人，Immunol.Rev.，16359-76，1998)。对应用于人的治疗而言，当HuIFN-L-Fc结合于细胞表面上的IFN受体时，融合蛋白的Fc区域必须不能有不良效应子功能，因此不会裂解或除去这些细胞。因此，HuIFN-L-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，即结合于FcγRs和C1q从而触发效应子功能方面，Fc区域必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生HuIFN-L-Fc融合蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列，已显示，CH2区域氨基端附近的Fc部分在IgGFc与FcγRs的结合中起作用。已用基因工程抗体证明在234位到237位基序的重要性(参见，如Duncan等人，Nature，332563-564，1988)。氨基酸残基编号是按Kabat等人所述的EU编号体系(《SEQUENCES of PROTEINS of IMMUNOLOGICALINTEREST》，第5版，United States Department of Health and HumanServices，1991)。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3与FcγRs的结合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组ＨｕＩＦＮ－Ｌ－ｖＦｃ融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白含有人ＩＦＮ、肽接头和人ＩｇＧＦｃ变体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金宜慧，孙乃超，周若云，
申请(专利权)人：旭华上海生物研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]