具有纤维二糖酶活性的多肽和编码其的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有纤维二糖酶活性的多肽和具有编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明专利技术还涉及核酸构建体、载体和包含该核酸构建体的宿主细胞以及制备和使用该多肽的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有纤维二糖酶(亦称β-葡糖苷酶)活性的多肽和具有编码本多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本专利技术还涉及核酸构建体、载体和含本核酸构建体的宿主细胞，以及制备和使用本多肽的方法。
技术介绍
纤维二糖酶是重要的降解生物量的酶。纤维二糖酶的这种用途是由植物材料生产乙醇过程中的一个关键步骤。考虑到环境因素，乙醇是一种吸引人的石油燃料代用品。纤维二糖酶的其它用途包括在果汁业中用于还原苦味化合物-如栎精。本专利技术的一个目的是提供具有纤维二糖酶(亦称β-葡糖苷酶)活性的多肽和编码本多肽的核苷酸序列。专利技术概述本专利技术第一方面涉及具有纤维二糖酶活性的多肽，其选自(a)包含这样一个氨基酸序列的多肽，此氨基酸序列与SEQ ID NO2中1至842位氨基酸所示序列具有至少80％同一性或者与SEQ IDNO2中1至351位氨基酸所示序列具有至少90％同一性；(b)包含这样一个氨基酸序列的多肽，此氨基酸序列与插入大肠杆菌(E.coli)DSM 14240的质粒中的核苷酸序列的编码部分所编码的多肽具有至少80％同一性；(c)由能够在中度严紧条件下与多核苷酸探针杂交的核苷酸序列编码的多肽，其中多核苷酸探针选自(i)SEQ ID NO1中87至2612位核苷酸所示序列的互补链，和(ii)SEQ ID NO1中87至1139位核苷酸所示序列的互补链；(d)具有纤维二糖酶活性的(a)、(b)或(c)的片断。本专利技术第二方面涉及多核苷酸，它具有能够编码本专利技术多肽的核苷酸序列。本专利技术第三方面涉及核酸构建体，它包含能够编码本专利技术多肽的核苷酸序列，且该序列可操作地连接一个或多个指导此多肽在适当宿主中产生的调控序列。本专利技术第四方面涉及包含本专利技术核酸构建体的重组表达载体。本专利技术第五方面涉及包含本专利技术核酸构建体的重组宿主细胞。本专利技术第六方面涉及用于产生本专利技术多肽的方法，其包括(a)培养野生型能够生产此多肽的菌株以产生此多肽；以及(b)回收此多肽。本专利技术第七方面涉及用于产生本专利技术多肽的方法，其包括(a)在有助于本多肽产生的条件下培养重组宿主细胞；以及(b)回收本多肽。本专利技术的其它方面可从下面的说明和所附的权利要求书中明显看出。定义进一步详细讨论本专利技术之前，首先定义下列术语和常规用语。基本上纯的多肽在本专利技术上下文中，术语“基本上纯的多肽”指的是多肽制备物中包含至多10％重量的其它天然相关的多肽物质(优选更低百分比——如至多8％重量，至多6％重量，至多5％重量，至多4％重量，至多3％重量，至多2％重量，至多1％重量和至多1/2％重量的其它多肽物质)。因此，优选的是基本上纯的多肽具有至少92％的纯度，即此多肽组成了制备物中总多肽物质重量的至少92％，优选更高的百分比纯度，如至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，以及至多99.5％纯。本文公开的多肽优选是基本上纯的形式。尤其，优选的是本文公开的多肽是“实质上的纯形式”，即多肽制备物中实质上没有其它天然相关多肽物质。举例来说，这种纯度可通过熟知的重组法制备多肽来得到。在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。纤维二糖酶活性术语“纤维二糖酶活性”在本文中被定义为β-葡糖苷酶活性，如在酶分类EC3.2.1.21中的定义，它催化末端的非还原性β-D-葡萄糖残基水解释放出β-D-葡萄糖。对本专利技术来说，根据实施例部分中“纤维二糖酶试验”描述的步骤测定纤维二糖酶活性。一个单位的纤维二糖酶活性定义为在40℃，pH5下每分钟产生2μmol葡萄糖。本专利技术多肽应优选具有由SEQ ID NO2中1至842位氨基酸所示氨基酸序列组成的多肽的纤维二糖酶活性的至少20％。在特别优选的实施方案中，多肽应具有由SEQ ID NO2中1至842位氨基酸所示氨基酸序列组成的多肽的纤维二糖酶活性的至少40％，如至少50％，优选至少60％，如至少70％，更优选至少80％，如至少90％，最优选至少95％，如大约或至少100％。同一性在本专利技术上下文中，两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的同源性通过参量“同一性”来描述。对本专利技术来说，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过可用于蛋白质和DNA序列比对(align)的Needleman-Wunsch序列比对法进行确定。对于蛋白质比对，使用的默认评分矩阵是BLOSUM50，缺口(gap)中第一个残基的罚分是-12，而缺口中其它残基的罚分是-2。比对可利用FASTA程序包v20u6版(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“生物序列分析的改良工具”，PNAS 852444-2448；和W.R.Pearson(1990)“利用FASTP和FASTA进行快速灵敏的序列比较”，酶学方法(Methods in Enzymology)，18363-98)的比对软件来执行。两个核苷酸序列之间的同一性程度可使用同一性矩阵为默认评分矩阵利用上述的相同计算法则和软件包进行确定。缺口中第一个残基的罚分是-16，而缺口中其它残基的罚分是-4。片断本文中，SEQ ID NO2的“片断”是指从这个氨基酸序列的氨基和/或羰基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。片断优选包含至少351个氨基酸残基，例如SEQ ID NO2中的1至351位氨基酸。等位变体在本专利技术上下文中，术语“等位变体”表示占据同一染色体座位的一个基因的两种或多种可变形式中的任一种。等位变异可以由突变天然地引起，并可引起种群内多态性。基因突变可能是沉默突变(所编码的多肽没有变化)或者可能编码氨基酸序列发生改变的多肽。多肽等位变体是由基因等位变体所编码的多肽。基本上纯的多核苷酸本文使用的术语“基本上纯的多核苷酸”指的是一种多核苷酸制备物，其中此多核苷酸已经离开其天然遗传环境，从而它不含有其它外来或不想要的编码序列并且它存在的形式适于在遗传工程蛋白质生产系统内进行使用。因此，基本上纯的多核苷酸包含至多10％重量的其它天然相关多核苷酸物质(优选更低百分比，如至多8％重量，至多6％重量，至多5％重量，至多4％重量，至多3％重量，至多2％重量，至多1％重量和至多1/2％重量的其它多核苷酸物质)。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选的是基本上纯的多核苷酸具有至少92％的纯度，即此多核苷酸组成了制备物中总多核苷酸物质重量的至少92％，优选更高的百分比纯度如至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，以及至多99.5％纯。本文所公开的多核苷酸优选为基本上纯的形式。尤其，优选的是本文所公开的多核苷酸是“实质上纯的形式”，即多核苷酸制备物中实质上没有其它天然相关的多核苷酸物质。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。修饰在本专利技术上下文中术语“修饰”指的是对由SEQ ID NO2中1至842位氨基酸所示氨基酸序列组成的多肽所进行的任何化学修饰，以及对编码此多肽的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是在目的氨基酸内或其所在位置处进行的氨基酸侧链置换，以及氨基酸替代、缺失和/或插入。人工变体术语“人工变体”用于本文指的是具有纤维二糖酶活性的多肽，该多肽由表达修饰基因(本文档来自技高网...

【技术保护点】
具纤维二糖酶活性的多肽，其选自：（ａ）包含这样的氨基酸序列的多肽，此氨基酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ：２中１至８４２位氨基酸所示序列具有至少８０％同一性或者与ＳＥＱＩＤＮＯ：２中１至３５１位氨基酸所示序列具有至少９０％同一 性；（ｂ）包含这样的氨基酸序列的多肽，此氨基酸序列与插在大肠杆菌ＤＳＭ１４２４０的质粒中的核苷酸序列的纤维二糖酶编码部分所编码的多肽具有至少８０％同一性；（ｃ）由能够在中度严紧条件下与多核苷酸探针杂交的核苷酸序列编码的多 肽，其中多核苷酸探针选自（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１中８７至２６１２位核苷酸的互补链，和（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１中８７至１１３９位核苷酸的互补链；（ｄ）具有纤维二糖酶活性的（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的片断。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M许莱因，J莱姆贝克，
申请(专利权)人：诺和酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]