新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L制造技术

一种噬菌粒展示载体，其特征在于在噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｘ的ＳｆｉⅠ和ＮｏｔⅠ酶切位点之间插入了含ＸｂａⅠ、ＳｔｕⅠ、ＳａｌⅠ和ＫｐｎⅠ酶切位点的核苷酸片段，插入片段的核苷酸序列为ＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧＧ ＴＡＣＣ。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，是一种应用于噬菌体展示外源随机多肽的新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L。
技术介绍
所谓噬菌体展示技术是利用噬菌体将外源多肽基因与噬菌体结构蛋白基因融合后用其将外源多肽展示于噬菌体表面的技术。由于噬菌体具有结构简单、体积小、单位体积个数多、易于复制、可悬浮于液体等特点，噬菌体展示技术已被广泛地应用于分子间相互作用的研究。其中主要包括利用亲和力选择从展示肽库中捕捉靶受体序列，进行表位鉴定或表位模拟，鉴定新的受体和天然配体，选择DNA结合蛋白，寻找新的药物，提供疫苗研制和疾病诊断的新途径，优化基因工程抗体等研究。丝状噬菌体为长杆状，长约1000nm，管直径约6nm。管中心是一约6400核苷酸的单链线状DNA。长管由约2700个主要外壳蛋白(PVIII)分子螺旋排列而成，其一端是各为5个拷贝的次要外壳蛋白PIII和PVI，另一端则是各为5个拷贝的次要外壳蛋白PVII和PIX。噬菌体通过PIII蛋白N端的200个氨基酸与细菌的F菌毛结合而感染细菌。1985年，George Smith首先开展了噬菌体展示的研究，他将内切酶EcoR I基因片段插入丝状噬菌体f1编码的噬菌体外壳蛋白III(PIII)基因的5’端，结果内切酶EcoR I被融合在外壳蛋白PIII的N端，从而展示在噬菌体表面。产生的重组噬菌体不仅仍具有感染性，而且能与EcoR I抗体结合，还能将EcoR I内切酶基因作为噬菌体基因组的一部分进行遗传和变异。目前，在噬菌体展示技术的应用中，外源多肽主要展示在PIII和PVIII两种外壳蛋白上，展示的主要方式有3型、8型、33型、88型、3+3型、8+8型6种形式，其中3+3型是被采用最多的展示方式。与Smith的展示方式不同的是，3+3型展示方式不是将外源基因直接插入噬菌体的PIII基因中，而是先将外源基因插入含有噬菌体PHI基因的噬菌粒中，再用野生型辅助噬菌体感染转化有上述重组噬菌粒的细菌，如此所得的重组噬菌体包裹有重组噬菌粒，其既含有部分野生型PIII蛋白，同时又有部分PIII蛋白的N端展示有外源多肽。由于重组噬菌体的5个PIII蛋白分子中仅有部分与外源展示多肽融合，所以减少了对噬菌体感染活性的影响。更重要的是噬菌粒的重组比在噬菌体基因组上进行基因重组操作来得简单，因而极大地方便了基因克隆操作过程，大大提高了外源多肽噬菌体展示的效率。目前用于随机多肽噬菌体展示的噬菌粒载体pCANTAB5X是一种应用较好的3+3型展示载体，它是通过对商用噬菌体单链抗体展示载体pCANYAB5E噬菌粒进行了酶切位点改造获得的，其在pCANTAB5E的Sfi I和Not I内切酶位点间插入了常用内切酶Xba I位点，有利于更多的DNA随机片段插入PIII外壳蛋白基因的5’端，从而增加了随机肽库的库容量。例如，利用pCANTAB5X载体成功地展示了HCV以及HGV核心蛋白的随机肽库(潘卫等，中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(4)359；吴晓兰等，第二军医大学学报，2000，21(9)842)。尽管如此，在用pCANTAB5X载体及其它噬菌粒载体进行外源多肽展示时，由于噬菌体的PIII外壳蛋白与被展示多肽直接融合，PIII蛋白会影响外源蛋白的正常折叠和空间构象，不利于保持被展示蛋白的原有活性和功能；同样，外源蛋白也会对PIII蛋白分子产生影响，因为5个PIII蛋白分子是聚集在一起的，尽管5个PIII蛋白中有野生型的PIII分子，但当展示大分子量的外源蛋白时，由于PIII分子与外源蛋白直接相连，其连接缺乏柔性，不能自由旋转，其巨大的空间结构也会对野生型PIII蛋白产生空间位阻，从而影响其感染活性，使重组噬菌体的产量降低；况且，pCANTAB5X仅含有Sfi I、XbaI和Not I 3个克隆位点，常用内切酶位点只有一个Xba I，所以它与其它商业化的噬菌粒载体同样存在着克隆位点尤其是常用内切酶位点数量少的问题，这给基因工程操作带来不便，特别是在构建随机展示肽库时限制了库容量。
技术实现思路
本专利技术提供一种既不影响噬菌体感染活性，又能保持外源蛋白原有活性和功能，并能多位点克隆的噬菌粒展示载体pCANTAB5L。本专利技术是对噬菌粒载体pCANTAB5X的一种改进。改进之一是增加了常用内切酶位点，由原来的含Sfi I、Xba I和Not I三个位点增加到含Sfi I、Xba I、Stu I、Sal I、Kpn I 5个位点，为外源展示多肽基因的克隆提供了更多可选择的克隆位点，这不仅方便了外源基因的定向克隆，提高了克隆效率，而且有利于扩大噬菌体展示肽库库容量；其二是引入了多肽接头基因3，其表达的多肽由15个氨基酸组成，位于噬菌体PIII蛋白和外源蛋白之间，而且在多肽接头基因3中适当使用了大肠杆菌稀有密码子，使外源蛋白和噬菌体PIII蛋白在蛋白质翻译过程中相隔一定时间，从而使外源蛋白在与之融合的噬菌体PIII蛋白被翻译之前有更多时间形成自己的空间构象，也正是因为多肽接头基因3的引入，使PIII蛋白和外源蛋白间隔15个氨基酸的多肽，从而进一步降低了PIII蛋白和外源蛋白之间在形成空间构像中的相互干扰。此外，该多肽接头具有高度柔性空间结构，既可自由摆动，又可自由旋转，这就使展示的外源多肽或外源蛋白获得更大的活动空间，不仅有利于外源多肽或外源蛋白活性的保持，而且由于外源多肽或外源蛋白能自由活动，即使外源蛋白分子较大，也不至于总遮挡住PIII蛋白，这就使PIII蛋白的感染活性不会受到外源蛋白太大的影响，因而能更好地保证所展示的随机肽库、功能靶蛋白变异体库具有很好的随机性和足够的库容，展示大分子量功能蛋白时重组噬菌体的滴度不受影响，。pCANTAB5L噬菌粒适用于展示随机肽库、功能蛋白、功能蛋白变异体和分子量较大(＞300个氨基酸)的功能蛋白。应用pCANTAB5L噬菌粒已成功地展示了重组人淋巴毒素(简称rhLT)变异体库、葡萄球菌A蛋白衍生物(简称Mu-proteinA)和人干扰素αA-2b(简称hIFNαA-2b)。本专利技术噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建，是通过基因工程操作方法，在噬菌粒展示载体pCANTAB5X的内切酶位点Sfi I和Not I之间插入一衔接片段来实现的。该衔接片段既包含Xba I、Stu I、Sal I和Kpn I内切酶位点，也包含3多肽接头基因，而3基因中又适当引入了大肠杆菌稀有密码子。将该噬菌粒转化细菌后，再用野生型辅助噬菌体感染该转化的细菌，就可得到包裹有pCANTAB5L噬菌粒的噬菌体。该噬菌粒载体就可用作展示外源多肽或外源蛋白的平台。pCANTAB5L的构建过程如下一.制备衔接片段Xba I-Stu I-Sal I-Kpn I-3-NotI(简称Linker)1.合成引物(1)正向引物Linker-U的核苷酸序列为5’-TCTAGAGGCCTGTCGACGGTACCGGCGGTGGTGGATCTGGT-3’该引物中含有4个酶切位点，亦即引入了4个多克隆位点Xba I(-TCTAGA-)，Stu I(-AGGCCT-)，Sal I(-GTCGAC-)和Kpn I(-GGTACC-)。(2)反向引物Linker-D的核苷酸序列为5’-AATGCGGCCGCACTGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫，沈毅君，刘彦君，戚中田，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，上海复旦张江生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：