新型α干扰素突变体及其制备方法技术

多种新型α干扰素突变体，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ１－４。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及多种和用途，特别是涉及一种高抗病毒活性的重组和用途。这类新型干扰素具有抗病毒活性高的优点。干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。至今哺乳动物的干扰素可以分为α、β、γ、ω等几型，其中α型干扰素又分为I型和II型。人干扰素的I型家族有20多个基因成员，其中大部分编码功能蛋白，彼此在核苷酸水平上有大约90％的同源性。而人干扰素的II型家族有5-6个基因成员，与I型家族有50％的同源性。1986年美国FDA首先批准基因工程α2a干扰素(Roche公司)和基因工程α2b干扰素(Schering公司)上市。基因工程β、γ干扰素也相继获准上市。我国科学家首创的α1b干扰素也于1996年正式获准上市。经临床大量研究证明，α型干扰素是一种重要的抗病毒和抗肿瘤治疗药物。另外美国Amgen公司根据13种α型干扰素的基因序列同源性，设计出一种全新的蛋白质工程药物-INFERGEN(干复津)，并经美国FDA批准1997年在美国上市，用于治疗丙型肝炎，其抗病毒活性是α2b干扰素的5-10倍。但副作用同时增加。本专利技术的目的在于通过体外进化技术对多种α型干扰素进行重组，获得活性更高，副反应更小，更适合于中国人治疗用的α型干扰素。在本专利技术之前，尚没有公开过本专利技术所涉及的新型干扰素突变体的氨基酸或核苷酸序列。本专利技术的目的是提供多种新型α干扰素突变体。其抗病毒比活性≥5×108IU/mg(采用干扰素效价测定常用的WISH细胞病变抑制法)。本专利技术的另一目的是提供编码这些蛋白的氨基酸序列。本专利技术的另一目的是提供构建这些蛋白基因表达的载体及其方法。本专利技术的另一目的是提供这些蛋白基因表达产物的纯化方法。本专利技术的另一目的是提供一个新型α干扰素突变体MIIFN。其抗病毒比活性≥8×108IU/mg(采用干扰素效价测定常用的WISH细胞病变抑制法)。本专利技术的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的人工合成高效表达DNA序列。本专利技术的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的氨基酸序列。本专利技术的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的高效表达载体及其构建方法。本专利技术的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的高效表达基因工程菌菌株及其构建方法。本专利技术的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN基因工程菌表达产物的纯化方法。本专利技术的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的相关理化性质。本专利技术所提供的新型α干扰素突变体具有高效的抗病毒活性，在治疗病毒性感染和癌症等疾病中具有应用前景。本专利技术中附图仅用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术的范围。附图说明图1.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN的人工合成DNA序列的PGR扩增结果。图2.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN重组质粒pET-rMIIFN经Nde I/BamHI双酶切后的电泳图谱。图3.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN重组质粒pET-rMIIFN在基因工程菌BL21(DE3)中的高效表达。图4.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN重组表达质粒pET-rMIIFN的稳定性考察。图5.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN种子库菌种表达量稳定性考察。图6.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN的纯化流程。图7.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN的基因工程表达纯化产物HPLC分子筛检测。图8.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN的基因工程表达纯化产物飞行时间质谱分析测定分子量。图9.是本专利技术的新型α干扰素突变体rMIIFN的基因工程表达纯化产物等电点测定。本专利技术实施方案概述对14种不同的α家族干扰素表达基因经DNase I酶消化成50bp-30bp大小的DNA片段后，通过无引物PCR方法随机重组，构建α家族干扰素分子体外进化文库。并通过对文库中阳性重组克隆序列测定，筛选有意义重组份子，并构建基因工程表达载体进行小量表达，然后对表达产物通过α家族干扰素单克隆抗体(由本公司自行研制)一步亲合纯化法获得纯度＞85％的样品蛋白，并且筛选抗病毒比活性≥1×108IU/mg的分子，并对这些分子进行DEAE阴离子交换-单克隆抗体亲合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺进一步纯化，得到纯度在95％以上的蛋白质样品。筛选比活性≥5×108IU/mg的分子。并将其作为高活性新型干扰素突变分子(纯度＞95％)，其氨基酸序列如附录SEQ ID NO1-4所示(MIFN1-4)。其中有一分子比活性≥8×108IU/mg，其氨基酸序列如附录SEQ ID NO4(MIFN4)，命名为MIIFN。根据rMIIFN氨基酸序列，采用大肠杆菌偏性密码子，合成了rMIIFN的全长DNA序列，将rMIIFN DNA亚克隆入表达载体pET-23b中，获得了可编码rMIIFN成熟蛋白的重组质粒pET-rMIIFN。该重组子在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS受体细胞中，可高效稳定的表达，表达产物主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白量的30％左右，经研究BL21(DE3)/pET-rMIIFN工程菌种稳定性很好。rMIIFN新型干扰素突变分子的高度纯化工艺采用了DEAE阴离子交换-Cu2+鏊合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。通过以上三步纯化，得到高纯度的rMIIFN。理化性质检测显示纯度达到98.92％；分子量为18856.96道尔顿；等电点在5.8-6.6之间；比活性≥8×108IU/mg(WISH细胞病变抑制法测活)。本专利技术是通过下列实施例进行实施实施例1体外进化文库的构建14种含有不同干扰素基因的质粒(α1b、α2b、α2a、α4b、α5、α6、α7、α8、α10、α14、α16、α17、α21和IFN-con)，均由北京三元基因工程有限公司提供。经NdeI和BamHI双酶切后，纯化回收500bp的干扰素DNA片段；将其等量混合至终浓度约为0.1μg/μl，DNase I酶消化2min，马上移至90℃水浴灭活10min，2％琼脂糖凝胶电泳回收50bp-30bp大小的片段。采用无引物PCR方法组装干扰素基因片段，反应条件为95℃ 3min，然后94℃ 30s，55℃30s，72℃60s共40个循环，最后72℃延伸7min。接着以上述无引物PCR产物为模板，用干扰素5’和3’端保守序列引物P1，P2为模板，进行PCR扩增引物根据α家族5’和3’端序列的保守特点，设计上游5’端2条引物，下游3’端3条引物，分别进行混合扩增。5’端2条引物1. 5’atgtgtgatttacctcaaactcat 3’2. 5’atgtgtgatttacctgaaactcat 3’3’端3条引物1. 5’ctattattctttacggcgcag 3’2. 5’ctattattctttactgcgcag 3’3. 5’ctattaatctttacggcgcag 3’反应条件为95℃3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃60s共30个循环，最后72℃延伸7min。产物经琼脂糖电泳分离后，选择500bp左右的DNA片段克隆进T-载体，连接反应具体如下进行DNA片段3μl，2×T4连接酶反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘耀波，杨轶，刘金毅，孙俭波，程永庆，
申请(专利权)人：北京三元基因工程有限公司，北京毕艾欧科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：