转化微生物、D-酰化氨基酸水解酶的制备方法技术

将在Ｄ－酰化氨基酸水解酶及Ｌ－酰化氨基酸水解酶中，选择性生成Ｄ－酰化氨基酸水解酶的Ｄ－酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的微生物中，进而获得转化微生物。将该转化微生物在含锌离子的培养基中进行培养，并从培养物中高效率地获得Ｄ－酰化氨基酸水解酶的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及将在D-酰化氨基酸水解酶及L-酰化氨基酸水解酶中，选择性生成D-酰化氨基酸水解酶的D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的微生物中形成的转化微生物，以及利用该转化微生物的D-酰化氨基酸水解酶制备方法。
技术介绍
高光学纯度的D-氨基酸是抗生物质的侧链和多肽类药物制备过程中所需的氨基酸，而D-酰化氨基酸水解酶是产业上用于制备D-氨基酸的酶。目前，作为可同时生成D-酰化氨基酸水解酶和L-酰化氨基酸水解酶的微生物， 已知如化学和药学通报(Chemical andPharmaceutical Bulletinn)26，2698(1978)报道的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)AAA6029株；特开昭53-59092号公报报道的橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)S·62等放线菌。利用这些微生物时，姑且不论D-酰化氨基酸水解酶生成能力，由于同时可生成作为光学异构体的D-酰化氨基酸水解酶和L-酰化氨基酸水解酶，因此明显的缺点是分离两者需要烦琐且高成本的操作。另一方面，作为选择性生成D-酰化氨基酸水解酶的微生物，已知如特开平1-5488号公报报道的反硝化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans)MI-4株。利用该菌种时，虽省却了分离D-酰化氨基酸水解酶和L-酰化氨基酸水解酶的麻烦，但D-酰化氨基酸水解酶的生成能力却显得不足。并且，由于在特开平1-5488号公报中并未阐明D-酰化氨基酸水解酶生成基因的碱基序列，因此无法改变基因以提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力和创建高生成性的转化微生物。鉴于以上所述，本申请的专利技术人森口等阐明了木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes xylosoxydans subsp.xylosoxydans)A-6株具有的D-酰化氨基酸水解酶生成基因的结构，相关碱基序列示于序列表的序列号1中。进而，本专利技术人通过对该D-酰化氨基酸水解酶生成基因加以一定的改变，显著提高了转化微生物的D-酰化氨基酸水解酶生成能力(Protein Expression and Purification 7，395-399(1996))。
技术实现思路
随后的研究表明，导入上述D-酰化氨基酸水解酶生成基因的各种转化微生物在含锌离子的培养基中，可大大提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力。尤其是将锌离子浓度控制在一定范围时，生成能力得以显著提高。再者，已知上述效果因宿主微生物的种类不同，其程度具有很大的差异。对于效果强的微生物，通常在转化前即可表现出锌耐受性。这种锌耐受性是指，以菌体量(A660nm)为繁殖能力测定指标时，添加锌离子难以抑制其繁殖能力。基于上述认识，可指出以下①、②两个事项。即，①其原因虽不明确，但存在一定量的锌离子时，携有序列表序列号1所示D-酰化氨基酸水解酶生成基因的转化微生物的表达可得到增强。②由于锌离子对于通常的微生物具有抑制作用，因此为确保锌离子的效果，有必要将原本就具有锌耐受性的微生物作为基因导入的宿主。基于以上观点，本专利技术提供用D-酰化氨基酸水解酶生成基因转化的微生物，通过向培养基中添加锌离子，该微生物的D-酰化氨基酸水解酶生成能力进一步大大增强。此外，本专利技术还提供利用上述转化微生物的D-酰化氨基酸水解酶制备方法。本专利技术的转化微生物具有下列特征将因锌离子的存在而使基因产物的表达得以增强的D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的宿主微生物中，进而获得在含锌离子的培养基中的D-酰化氨基酸水解酶高表达性性状；该转化微生物是用D-酰化氨基酸水解酶生成基因进行转化的微生物，通过向培养基中添加锌离子，可最大限度地增强D-酰化氨基酸水解酶生成能力。本专利技术的转化微生物中，更优选上述D-酰化氨基酸水解酶生成基因或具有序列表的序列号1所示的碱基序列，或者具有可与序列表的序列号1所示的碱基序列在严格条件下杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列。已知具有序列表的序列号1所示碱基序列的D-酰化氨基酸水解酶生成基因，在存在锌离子的条件下，可更为显著地增强基因产物的表达。因此，可与序列表的序列号1所示碱基序列在严格条件下杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列也有望具有同样的特征。本专利技术的转化微生物中，更优选的宿主微生物为大肠杆菌。已知大肠杆菌具有锌耐受性。并且，对于大肠杆菌的菌体学性质、生理性质、培养条件和管理条件等也已熟知。因此，D-酰化氨基酸水解酶的高效生产可在相对容易的生产管理条件下进行。本专利技术的转化微生物中，更优选对于导入宿主微生物的D-酰化氨基酸水解酶生成基因进行以下(1)和/或(2)的修饰。(1)在核糖体结合区域设计特定的碱基序列(GAAGGA)，并导入基因的翻译起始位点上游9个碱基的位置，进而提高翻译效率。通过这种修饰，可提高D-酰化氨基酸水解酶生成基因的翻译效率。(2)在基因的上游和下游设置大肠杆菌的Hind III识别位点，纯化该基因并酶切后连接于表达载体，进而提高基因的表达效率。通过这种修饰，可提高D-酰化氨基酸水解酶生成基因的表达效率。可应用锌耐受性微生物作为以获得本专利技术转化微生物为目的的宿主微生物。更为具体地说，可应用以菌体量(A660nm)的增加或减少为指标测定培养基中的繁殖能力时，添加锌不会过于抑制其繁殖能力的微生物。作为锌耐受性的一个判断标准，例如相对于该微生物在未添加锌的培养基中的菌体量(A660nm)，添加2mM锌的同一条件培养基中的菌体量的增加或减少程度止于10％以内。或者，例如添加5mM锌的同一条件培养基中的菌体量的增加或减少程度止于20％以内。对于宿主微生物的分类上的种类没有特殊的限制，一般来说，优选形态学性质和生理学性质均已熟知，且其培养条件和管理条件已知的宿主微生物。作为宿主微生物的优选例，例如大肠杆菌(Eschericiacoli)。相反，含有上述A-6株的木糖氧化产碱菌种的微生物与大肠杆菌相比，不具备锌耐受性。对于D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入宿主微生物的方法没有特殊的限定，例如可根据情况任意选择连接质粒后导入的方法，及连接于噬菌体DNA后导入的方法等。本专利技术的D-酰化氨基酸水解酶生成基因是在D-酰化氨基酸水解酶及L-酰化氨基酸水解酶中选择性生成D-酰化氨基酸水解酶的基因，该基因的表型为，培养基中存在锌离子时，其活性表达可进一步得到增强。作为已确定为该类型D-酰化氨基酸水解酶生成基因而优选的一个例子，例如具有序列表的序列号1所示碱基序列。或者，具有在严格条件下，可与序列表序列号1所示碱基序列杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列，但实际上其活性表达不能因培养基中存在锌离子而得以增强的除外。具有序列表的序列号1所示碱基序列的D-酰化氨基酸水解酶生成基因由上述木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenesxylosoxydans subsp.xylosoxydans)A-6株获得。该A-6株是从自然界的土壤中筛选得到的D-酰化氨基酸水解酶生成菌。本专利技术的D-酰化氨基酸水解酶的制备方法为，在含锌培养基中培养上述的任一转化微生物，并从该培养物获得D-酰化氨基酸水解酶。锌离子的供给，例如可通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化微生物，其特征在于，将因锌离子的存在而使基因产物的表达得以增强的Ｄ－酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的宿主微生物中，进而获得在含锌离子的培养基中的Ｄ－酰化氨基酸水解酶高表达性性状。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：竹内贤一，小出芳直，广濑芳彦，森口充瞭，矶部公安，
申请(专利权)人：天野酶株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]