动物狂犬病病毒糖／核蛋白“二价”DNA疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种动物狂犬病病毒糖／核蛋白“二价”ＤＮＡ疫苗，是通过ＲＴ－ＰＣＲ和克隆技术获得了狂犬病病毒ＳＲＶ↓［９］克隆株糖蛋白ｃＤＮＡ和核蛋白ｃＤＮＡ，以上述糖蛋白和核蛋白ｃＤＮＡ为目的基因，分别制备了以ｐＶＡＸ１和ｐＩＲＥＳ为载体的基因疫苗。将两种基因疫苗联合（“二价”），以裸质粒形式或以司苯－甘油为佐剂形式免疫小鼠和犬３－４次后，免疫动物可产生良好的体液免疫和细胞免疫。该“二价”ＤＮＡ疫苗无感染性，使用安全，免疫效果明确。是预防狂犬病的一种新型疫苗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物狂犬病病毒糖/核蛋白“二价”DNA疫苗，特别是涉及一种以狂犬病病毒SRV9克隆株的糖蛋白和核蛋白基因构建成的“二价”DNA疫苗。具体地说是利用狂犬病病毒的糖蛋白和核蛋白cDNA分别和同时正向克隆到pVAX1或pIRES载体上，以糖/核蛋白二者cDNA的表达载体溶液免疫动物，可使被免疫动物产生免疫保护的新型狂犬病疫苗。
技术介绍
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染引起的一种重要人畜共患传染病，人和动物一旦发病，即可导致100％死亡。我国每年统计到的因狂犬病死亡的人数达600-6000人。人狂犬病的发生均由犬等狂犬病动物咬伤引起，现行的用于动物狂犬病预防的疫苗包括灭活苗和弱毒苗，在我国主要是弱毒活疫苗。灭活苗在制成前需要进行浓缩，成本很高，目前不适于在我国大面积使用，而且灭活苗存在“多数复活”的可能；弱毒活疫苗制备容易，但在易感动物体内存在毒力返祖的潜在可能，对于生态环境和人类均是一个潜在的威胁。近年来，通过分子生物学和基因工程的手段相继研制了一系列的狂犬病多肽苗、亚单位苗、抗独特型抗体苗、重组活载体苗以及基因疫苗。这些疫苗均以狂犬病病毒糖蛋白为目的抗原，应用时安全，并具有一定的免疫保护效果。在狂犬病病毒结构蛋白中，糖蛋白是诱导机体产生中和性抗体的唯一成份，但核蛋白可诱导特异性细胞免疫，并能促进中和抗体的产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种动物狂犬病病毒糖/核蛋白“二价”DNA疫苗，DNA疫苗(又叫基因疫苗)是以真核表达载体为调控盒、以可表达出目的抗原的基因或其cDNA为应用形式的新型疫苗。其制备简单，使用安全，贮存方便，并且还可以随意制成多价或多联疫苗。基于狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白均具有一定的免疫保护原性以及DNA疫苗的特点，本专利技术将二者的DNA疫苗联合即两个表达载体混合或将二者cDNA克隆到同一载体上，研制了狂犬病病毒二价DNA疫苗。本专利技术的技术方案是这样实现的从狂犬病病毒SRV9株培养物中提取总RNA，以其为模板利用M-MLV反转录酶反转录出cDNA；分别利用糖蛋白和核蛋白特异引物通过Taq-plus DNA聚合酶对cDNA进行PCR扩增，回收PCR产物，将其连接至T载体中，测序。结果表明，糖蛋白核苷酸序列与其母源株SAD B19相比，在158、575、931位碱基分别出现了G→A、A→G、A→G转换，导致相应的第53位、192位、311位氨基酸出现了Gly→Glu、His→Arg、Thr→Ala的改变，与ERA株相比有10个碱基不同，7个氨基酸发生改变。Jameson-wolf抗原表位优势分析发现，SRV9在192位氨基酸的改变，导致该部位产生了一个新的抗原位点。核蛋白核苷酸序列与其母源株SAD B19同源性100％。利用基因重组技术将狂犬病病毒SRV9克隆株的糖蛋白、核蛋白cDNA克隆至pVAXl和pIRES载体中的CMV启动子下游，构建成基因疫苗。通过碱裂解方法大量制备基因疫苗质粒DNA，按每只鼠50μg质粒DNA/100μl或每条犬200μg质粒DNA/1ml，并按1μgDNA0.5μl司苯-甘油比例混匀，或以裸质粒形式，肌肉注射免疫试验动物，共免疫三次，间隔两周。免疫前及免疫后14天采血，分离血清，并在最后采脾培养脾细胞。采用ELISA测定特异性抗体水平；采用MTT法(代谢法)测定细胞免疫水平。结果显示，加强免疫后，免疫动物特异性抗体水平和细胞免疫水平显著升高。抗体阳转率为100％。本专利技术的积极效果是制备简单，使用安全，贮存方便，免疫效果良好，是预防狂犬病的一种新型疫苗。1.狂犬病病毒SRV9株糖蛋白cDNA的获得狂犬病病毒SRV9株是由SADB19株经蚀斑克隆获得的口服弱毒疫苗株，经田间试验表明该毒株对犬安全、免疫原性好。根据狂犬病病毒糖蛋白cDNA序列设计一对引物即P15′-CCA CCA TGG TTCCT CAG GCT CTC CT-3′，P2 TAC AGT CTCACC CC-3′(阴影部分为Not I识别位点)。经RT-PCR扩增，获得糖蛋白全长cDNA，其1588bp序列如下 atggttcctcaggctctcctgtttgtaccccttctggtttttccattgtgttttgggaaattccctatttacacgataccagacaagcttggtccctggagtccgattgacatacatcacctcagctgcccaaacaatttg gtagtggaggacgaagaatgcaccaacctgtcagggttctcctacatggaacttaaagttggatacatcttagccataaaagtgaacgggttcacttgcacaggcgttgtgacggaggctgaaacctacactaacttcgttggttatgtcacaaccacgttcaaaagaaagcatttccgcccaacaccagatgcatgtagagccgcgtacaactggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgtaccctgactaccgctggcttcgaactgtaaaaaccaccaaggagtctctcgttatcatatctccaagtgtggcagatttggacccatatgacagatcccttcactcgagggtcttccctagcgggaagtgctcaggagtagcggtgtcttctacctactgctccactaaccgcgattacaccatttggatgcccgagaatccgagactagggatgtcttgtgacatttttaccaatagtagagggaagagagcatccaaagggagtgagacttgcggctttgtagatgaaagaggcctatataagtctttaaaaggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctaggacttagacttatggatggaacatgggtctcgatgcaaacatcaaatgaaaccaaatggtgccctcccgataagttggtgaacctgcacgactttcgctcagacgaaattgagcaccttgttgtagaggagttggtcaggaagagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatGgcaaccaagtcagtgagtttcagacgtctcagtcatttaagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatataccatattcaacaagaccttgatggaagccgatgctcactacaagtcagtcagaacttggaatgagatcctcccttcaaaagggtgtttaagagttggggggaggtgtcatcctcatgtgaacggggtgtttttcaatggtataatattaggacctgacggcaatgtcttaatcccagagatgcaatcatccctcctccagcaacatatggagttgttggaatcctcggttatcccccttgtgcaccccctggcagacccgtctaccgttttcaaggacggt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种动物狂犬病病毒糖／核蛋白“二价”ＤＮＡ疫苗，是以狂犬病病毒ＳＲＶ↓［９］克隆株糖蛋白和核蛋白ｃＤＮＡ经以下步骤分别构建出以ｐＶＡＸ１和ｐＩＲＥＳ为载体的基因疫苗；（１）、从克隆载体ｐＴＧ中通过ＰｓｔⅠ和ＸｂａⅠ酶切将糖蛋白ｃＤＮＡ克隆入经相同酶切的ｐＶＡＸ１中，构建重组疫苗ｐＶＧ；（２）、从克隆载体ｐＴＮ２中用ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ酶切将核蛋白ｃＤＮＡ克隆入经ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＶ酶切的ｐＶＡＸ１中，构建重组疫苗ｐＶＮ；（３）、从克隆载体ｐＶＧ用ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ酶切将糖蛋白ｃＤＮＡ克隆入经ＥｃｏＲＶ酶切的ｐＩＲＥＳ中构建重组表达载体ｐＩＧ；（４）、从克隆载体ｐＴＮ２中用ＨｉｎｃⅡ和ＸｂａⅠ酶切将核蛋白ｃＤＮＡ克隆入经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ酶切的ｐＩＧ中构建重组疫苗ｐＩＧＮ；（５）、将上述ＤＮＡ疫苗经碱裂解法制备后，８００～４０００μｇ／ｍｌ溶于生理盐水中，按糖蛋白∶核蛋白按２５－１００μｇ∶２５－１００μｇ／１００μｌ比例混合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：扈荣良，张守峰，袁慧君，
申请(专利权)人：中国人民解放军军需大学军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]