通过永久性遗传修饰其生物膜而由病原微生物产生非强毒微生物用于制备疫苗的方法技术

我们在这里描述了一种通过永久性遗传修饰其膜物理状态（ＭＰＳ）而由病原微生物产生非强毒微生物的方法学。从而，在侵染之初，在这些修饰的生物体中，当它们侵染宿主（如高等真核生物，特别是哺乳动物的靶细胞，更具体的是人类细胞），或者将其注射到动物侵染模型中，热激（应激）基因表达和其编码蛋白（应激蛋白或ＨＳＰ）积累以及其他物种特异性基因产物积累时，作为ＭＰＳ修饰的结果，其调控被改变。除此之外，我们还提到由信号转导路径所介导调控的基因。所以，作为这一措施的结果，病原体成为非强毒的（减毒活性生物体），可用于疫苗制备。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过永久性遗传修饰其生物膜而由病原微生物产生非强毒微生物(non virulent microorganisms)的方法。特别地，本专利技术的方法提供了对膜的物理状态和/或动力学状态的修饰，以获得可用于疫苗制备的修饰的病原体。本专利技术还涉及这样获得的疫苗。以下说明书中所用的术语MPS膜物理状态克隆载体含有使其在转染宿主后得以复制的完整遗传信息的DNA分子。去饱和酶基因编码去饱和酶的基因，该酶在饱和脂肪酸(SFA)酰基链的特定位置(Δ6、Δ9、Δ12等)引入双键以形成不饱和脂肪酸(UFA)。差示扫描量热法一种研究生物膜的热改变行为(thermotropicbehavior)的技术。随着生物膜的温度从其脂质成分(或者是其具有特定脂质头部基团和脂肪酰链的区域)的凝胶温度升高到液晶相变，烃链的活动性增强并发生相应的热吸收的增加。凝胶到液体的脂质相变一般是在低于或围绕该生物体的生长温度左右完成的。高温热转变通常归因于蛋白变性，并且，与脂质转变形成对照，是不可逆转的。基因表达该术语是指生物体通过中间分子mRNA合成由特定基因所编码的蛋白质的全过程。热激基因(应激基因)普遍存在的基因，当细胞暴露于突然升高的温度和/或各种不同形式的应激时迅速转录激活。应激的可诱导性由这些编码序列启动子区域特定顺式作用元件(如热激元件，HSE)的存在而获得。热激蛋白(HSP或应激蛋白)暴露于应激后细胞所迅速积聚的热激基因的蛋白质产物，并且其功能包括指导新生多肽正确折叠、靶向变性蛋白(错误折叠的)、保护线粒体和叶绿体的功能、mRNA成熟、其插入膜中以保护MPS，等等。整合性(或内在性)膜蛋白部分或完全地与磷脂双层的疏水区相互作用，并且只能用去垢剂从膜中提取的任何膜蛋白。巨噬细胞存在于血液、淋巴和其他组织中的细胞。其功能是吞噬和破坏病原体。有些巨噬细胞负责B和T淋巴细胞的激活。膜包围真核及原核细胞、细胞器(如线粒体、叶绿体、内质网、细胞核等)的半透性屏障，由脂双层(磷脂、糖脂和固醇)组成，其中存在着内在性膜蛋白或缔合蛋白。作为本专利技术描述的遗传操作的结果，所有的膜MPS均经历细胞特异性的变化。膜流动性描述膜内分子的相对扩散运动的一种广为应用但主观的术语。采用流动性而不是粘性，是因为膜是平面的不对称结构，并且其特性与体相(bulk phase)不具可比性。术语流动性旨在传达发现于脂质呈液体-晶体层状相的功能膜中的侧向扩散、分子摇摆和链伸缩的印象。膜秩序(Membrane order)膜内分子或分子域的运动动作。膜秩序可通过估计顺磁探针的运动和计算来自ESR或NMR光谱的秩序参数(order parameter)予以量化。非层状相脂质在水介质中的非双层排列。可以是六角形(HI)或倒六角形(HII)排列；膜中很少发现有HI相。PCR(聚合酶链式反应)利用互补于靶基因序列的特定寡核苷酸引物由专门的热稳定DNA聚合酶体外大量合成特定核苷酸序列的技术。pG13含有处于瘰疬分枝杆菌(M.marinum)启动子(命名为PG13，acc.#AF092842)转录调控之下的大肠杆菌(E.coli)绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒。PG13是σ70-样启动子，在瘰疬分枝杆菌(M.marinum)和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)中均有发现，其在巨噬细胞中的诱导作用比分枝杆菌hsp60启动子要高40倍左右。pNir体内厌氧诱导的质粒，含有大肠杆菌(Escherichia coli)pNirB启动子，受细菌蛋白FNR的调控，后者在厌氧条件下激活(Dunstan等，1999)。启动子RNA聚合酶起始转录的特定DNA区域。该启动子区域含有RNA聚合酶的识别位点。信号转导途径物理(如温度、摩尔渗透压浓度)化学(如激素)形式信号向其他形式信号的转化。在细胞生物学中，该术语是指由于化学因子与膜或细胞受体的相互作用或者因对膜的物理效应而引起的系列过程，其在一个或多个特定的细胞应答中达到顶点(如处于这种调控之下的序列的基因转录激活)。转化通过DNA重组技术获得蛋白的方法，需要克隆编码给定蛋白的基因，其中“克隆”是指分离、纯化并测序编码所述蛋白的基因。一经克隆，该核苷酸序列可被插入合适的表达载体中，而所得的DNA重组分子可被引入到微生物中，在那里该基因与宿主DNA同时复制。该基因最终可用分子生物学标准技术重新予以分离。毒力基因这些基因被定义为编码对宿主有毒的分子(毒素)或者编码对于胞内病原体在宿主环境内生存所必需的蛋白产物的那些遗传性状。因此，编码这些性状的几个基因很可能是响应物理和/或环境的变化例如不同形式的应激而加以调控。
技术介绍
热激反应，或者应激反应，是一种研究的较好的稳态细胞应答，主要是应答变化多样的外界应激和/或病理状态而参与细胞功能的维持。这一应答通过迅速增加那些编码应激蛋白的基因的转录而介导(Lindquist.1986)。已大量证明这种应激基因mRNA合成的增加，以及相关的胞内HSP的积聚，与耐热性的获得有关，伴随着对后来暴露于其他形式的应激或病理条件下的保护等(Singer和Lindquist 1998；van Eden和Young 1996)。业已证明温度变化的初级传感器，并且一般而言，其他形式应激的初级传感器，是定位于膜上的(Carratù等1996；Horvath等1998，Vigh和Maresca，1998；Suzuki等2000，Piper等2000；Torok等2001；Vigh和Maresca，1998)。进一步的，最近的研究表明突然的温度变化或者暴露于其他形式的应激，决定了脂质和蛋白膜组分的物理重建(Slater等1994)，继之而来的是特定的基因应答，旨在补偿MPS的变化。从而，在MPS的变化与基因表达的调控之间存在着对话(cross-talk)，特别是对于热激基因而言。我们将注意力集中在膜作为热激的初级靶的重要角色方面，并尝试了解膜内适当的脂质/蛋白互作是如何决定HS基因的转录调控的。这种分子互作已被证明精密地参与从外界到后续过程中的物理和化学信号转化，最终，以特定的方式，转录激活应激调控基因。反过来，某些HSP和膜特定区域(微区(domain))之间的互作重塑膜的物理状态情况(整体相态、秩序、通透性等)。我们已证明，通过这些膜微区的不均匀分布，精确感知生物学和物理学环境调控信号以及不同形式应激，可获得基因表达特异性。这些研究有力地修正了我们对生物膜功能的观点。我们提出膜的组成、结构和物理状态在急性热激和病理状态期间的细胞应答中起着重要的和决定的作用(Vigh和Maresca，1998)。在造成适当MPS的试剂中，我们提及去饱和酶，通过其酶活，其调控膜的磷脂组成。去饱和酶是向SFA中引入双键形成UFA的酶。SFA/UFA比是决定所有细胞的适当MPS的关键因素之一(Cossins，1994)。最近证明可诱导性HSP的合成受许多因素突然和局部变化的调控，这些因素包括●膜脂组成●膜脂质/蛋白互作●膜脂动力学(MPS修饰)(Vigh等1998，Vigh和Maresca，未发表，1998)从而，应激条件下MPS的变化重新确定HSP正常合成的阈值。胞内病原体，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhim本文档来自技高网...

【技术保护点】
将病原微生物转化为非强毒微生物的方法，包括步骤：在所说的病原体中诱导遗传修饰，以使它们诱导它们所接触的宿主细胞的生物膜的物理学和／或动力学状态发生改变。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R辛克布莱尼，S克罗纳罗马诺，
申请(专利权)人：布瑞恩技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]