氧化还原酶制造技术

本发明专利技术涉及一种可从乳杆菌取得的ＮＡＤＰＨ－依赖性氧化还原酶，涉及以对映体选择的方式将２－含氧酸酯类还原成相应的手性Ｓ－２－羟基酸酯类的酶的方法，以及经由酶－偶联的辅酶再生反应，以对映体选择方式取得Ｓ－２－羟基酸酯类的酶的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及氧化还原酶，该氧化还原酶的片段及分离出的DNA序列，以该氧化还原酶或该片段为基础的融合蛋白质，及以对映体选择性的取得S-2-羟基酸酯类的方法。现有技术2-羟基酸及其酯类为重要的手性基础合成构造块，由此，可衍生出多种在C2原子处仍保有手性的化合物，例如环氧化物、烷基酯类、肼基酯类、α-N-烷氧氨基酯类或α-氨基酯类。先前已有许多研究致力于发展用于制备对映体异构上纯的2-羟基酸类及其酯类的方法，且已考虑过许多不同的化学及生物催化方式。直到现在仍无法发展出可满足工业制造规模要求的方法。以酶-催化方式引入手性中心的方法显示优于化学催化合成的方法，尤其是在制备2-羟基酸类及其酯类方面。目前以酶-催化的方法包含三种不同的方法。一种途径为经由氧腈酶催化来合成手性氰醇类，再接着将其水解，此反应通常亦由酶催化(Biotransformations in Organic Chemistry，A Textbook.4thedition，Springer(2000)，K.Faber；Cyanohydrin formation)。此方法具有使用毒性HCN的缺点。另一种方法是由脂酶(例如来自荧光假单孢菌)辅助来解析2-羟基酸酯类(J.Org.Chem.55，812-815(1991)，Kinetic Resolution of2-substituted Esters catalysed by a Lip ase Ex.Pseudomonasnuoreszens，Kalaritis，P.et al.)。此方法的缺点为理论产量仅有50％。另一种方法为经由还原前手性2-含氧酸类或其酯类来合成手性2-羟基酸类及其酯类。以全酵母细胞，或以普通变形菌或奇异变形菌的细胞转化，或利用分离出的酶来进行的方法已为人所知。在以全酵母细胞转化的情况中，还原酶对2-含氧酸类的作用是来自于乳酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶(Ramesh N.Patel Stereoselective Biocatalyse，NY(2000)，14.Stereoselective Synthesis of Chiral Compounds UsingWhole-Cell Biocatalysis，Paola D‘Arrigo，Giuseppe Pedrocchi-Fantoniand Stefano Servi)，而在以变形菌进行的还原反应中，此反应显然由一种经细胞膜连接的钼-依赖性铁-硫蛋白质所引起(Eur J Biochem(1994)；222(3)1025-32，The(2R)-hydroxycarboxylate-viologen-oxidoreductase from Proteusvulgaris is a molybdenum-containing iron-sulphur protein，TrautweinT，Krauss F，Lottspeich，F，Simon H)。在已知的用来还原2-含氧酸酯类的方法中，其使用分离的酶类(D/L)-乳酸脱氢酶(US 5,686,275)、(D/L)-二羟基异己酸脱氢酶(US6,033,882)和D-扁桃酸脱氢酶(Appl Environ Microbiol 2002 Feb；68(2)947-51，Two forms of NAD-dependent D-mandelatedehydrogenase in Enterococcus faecalis IAM 10071.Tamura Y.et al10)，这些酶亦可以为克隆的、过表达的和市售形式的。这些酶为NADH-依赖性的，并且不会转化2-含氧酸酯类。现已进一步知道还原2-含氧酸类或其酯类的酶不会转化仲醇。而且，以甲酸脱氢酶(如来自博伊丁假丝酵母或来自荧光假单孢菌的重组形式的)重新产生辅酶NAD的方法已为人所知(Biotechnology，Biotransformations I(Rehm and Reed)9.AlcoholDehydrogenases-Characteristics，Design of Reaction ConditionsJ.Peters，WILEY-VCH-Verlag，(1998))。本文中由实施例来陈述此种由来自表皮葡萄球菌的D-乳酸脱氢酶制备R-2-羟基-4-苯基丁酸的方法(Industrial Biotransformations，Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，WILEY-VCH-Verlag，(2000))。利用甲酸脱氢酶来重新产生辅酶的缺点为该甲酸脱氢酶的特异活性低(4-10单位/毫克)，且制备此酶的花费高。因此，从经济观点来看，此酶需使用数次，而实质比较下，这造成更为复杂、更昂贵的控制过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是以氧化还原酶去除所述现有技术方法的缺点。根据本专利技术，此目的可在NADPH和水的存在下，由可将2-含氧酸酯类还原成相应的S-2-羟基酸酯类的氧化还原酶来实现。尤其是，本专利技术涉及例如可从路氏乳杆菌(Lactobacillus(L.)reuteri)、克非利乳杆菌(L.kefiri)、坎得利乳杆菌(L.kandleri)、类布氏乳杆菌、纤维二糖乳杆菌或发酵乳杆菌取得的氧化还原酶。本专利技术还涉及具有根据如附属序列表中所描述的SEQ ID NO19的DNA序列和SEQ ID NO18的氨基酸序列的路氏乳杆菌氧化还原酶。本专利技术还涉及其中有超过70％的氨基酸与氨基酸序列SEQ IDNO18相一致的氧化还原酶，且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，其具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。优选的氧化还原酶为其中有80％-99.5％的氨基酸与SEQ ID NO18的氨基酸序列相一致的氧化还原酶，更优选的为有90％-99.5％相一致，尤优选有99％-99.5％的一致。根据SEQ ID NO18的氧化还原酶或其衍生物或类似物的特异活性利用实施例2中所描述的分析测量。本专利技术还涉及一种氧化还原酶，其比具有氨基酸序列SEQ IDNO18的氧化还原酶多出1-50个氨基酸或减少1-50个氨基酸，且其根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应而定具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。优选的氧化还原酶为那些比氨基酸序列SEQ ID NO18多出或减少1-25个氨基酸的，尤其是多出或减少2-20个氨基酸的，而优选多出或减少3-10个氨基酸的。本专利技术还涉及一种氧化还原酶，其具有SEQ ID NO18氨基酸序列，并曾以水溶性聚合物修饰过一次、二次、三次、四次或五次，且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，其具有超过l微摩尔/毫克的特异活性。一种水溶性聚合物的实例为聚乙二醇。聚乙二醇优选连接根据SEQ ID NO18的氧化还原酶的N-端。根据SEQ ID NO18的氧化还原酶亦可连接至固体上，如聚乙烯、聚苯乙烯、多醣、纤维素或纤维素衍生物。本专利技术还涉及一种具有5-30个氨基酸，代表氨基酸序列SEQ IDNO18的片段的氧化还原酶片段。此种片段优选具有6-25个氨基酸的氨基酸链的SEQ ID NO18的片段，以具8-20个氨基酸更优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氧化还原酶，其在ＮＡＤＰＨ和水的存在下，将２－含氧酸酯类还原成相应的Ｓ－２－羟基酸酯类。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M鲍克瓦，A谷普达，A泽姆尔，
申请(专利权)人：于利希酶产品有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]