编码人珠蛋白基因的载体及其在治疗血红蛋白病中的应用制造技术

重组慢病毒载体，所述载体含有一个编码功能性珠蛋白基因的区域；和β－珠蛋白基因座调控区的大部分区域，该区域包括Ⅰ型ＤＮＡ酶超敏位点ＨＳ２、ＨＳ３和ＨＳ４，当导入哺乳动物如人时，它可使β－珠蛋白在体内表达。任选地，该载体进一步包括一个编码二氢叶酸还原酶的区域。该载体可以用于治疗血红蛋白病，包括β－地中海贫血和镰状细胞贫血病。例如，造血祖细胞或干细胞可以在体外被转化，然后再回输到患者。可采用选择步骤以提高回输群体中转化细胞的百分率。例如，采用一种可使转化细胞比未转化的细胞具有更强药物抗性的选择标记便可用相应的药物处理细胞以进行选择。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
关于政府基金的声明本申请由NHLBI提供基金支持，号码为HL57612。美国政府可享有本专利技术的某些权利。关于相关申请的声明本申请要求2001年6月29日提交的美国临时申请US 60/301,816和2001年7月2日提交的美国临时申请号US 60/302,852的优先权，在此将其并入以供参考。
技术介绍
本申请涉及一种包含哺乳动物尤其是人珠蛋白基因的载体，并涉及其在治疗包括β-地中海贫血症和链状细胞贫血病在内的血红蛋白病中的应用。对于β-地中海贫血症，现有的治疗方式包括血红细胞输血加上铁离子鳌合作用(可以延长生存时间，但是麻烦、昂贵并且是一种不完全的治疗方法)，或者异体骨髓移植(该方法存在致命的危险并且对于大多数患者来说也是不适用的)。因此，需要一种替换方法来推动治疗进程。本专利技术提供一种自身移植造血干细胞的基因校正方法，从而采用基因治疗提供一种低危险和更加有效的长期治疗方法。尽管基因治疗已经提出了许多年，但在努力发展基因治疗载体中所面临的一个重大挑战是分泌预期蛋白或肽达到治疗有效水平的能力。本专利技术提供一种迄今为止能够提供治疗意义水平上人珠蛋白的载体。这种能力的提高来自于转入了大量的可调控治疗基因表达的基因调控序列。专利技术概述本专利技术提供了一种重组慢病毒载体，它包含(a)包含功能性珠蛋白基因的区域；和(b)β-珠蛋白基因座调控区的大部分，其中包括DNA酶I超敏位点HS2、HS3和HS4的大部分。该区域可以是完整位点或者是与如下特定序列具有相同功能的截短的位点。等该载体被导入哺乳动物如人时，它可使β-珠蛋白在体内表达。任选地，该载体进一步包含一个编码二氢叶酸还原酶的区域。通过导入不同的珠蛋白基因，本专利技术的载体可以用于治疗血红蛋白病，包括α-和β-地中海贫血和镰刀状细胞贫血疾病。例如，造血祖细胞或干细胞可以在体外被转化，然后再回输到患者。可以加入选择步骤对回输细胞群进行选择以提高转化细胞的百分率。如一种选择标记，其使转化的细胞比未转化的细胞具有更强的药物抗性，可以用相应的药物处理后进行细胞的选择。选择和/或富集也可以在体内进行，例如用氨甲喋呤或类似的叶酸拮抗物来选择由于载体中二氢叶酸还原酶(DHFR)表达而具有抗性的细胞。 附图说明图1显示本专利技术重组致癌逆转录病毒载体的基因组结构。图2显示在本专利技术范围内的重组致癌逆转录病毒载体的基因组结构。图3显示证明转化的MEL细胞中平均β-珠蛋白表达升高的实验结果。图4显示外周血细胞中的平均载体拷贝数，检测周期为24周，上述结果进一步表明应用本专利技术的载体可以对细胞进行高效率的基因传递。图5A和B显示，在引入用本专利技术的载体转化的细胞12天和22周后，每个内源等位基因表达人β-珠蛋白的情况。图6显示用未选择的TNS9-转导Hbbth3/+骨髓移植15周后的血细胞比容水平、血红细胞计数、网织红细胞计数和血红蛋白水平。专利技术详述本专利技术的第一个方面提供了一种重组的慢病毒载体，它包含(a)一个包含功能性珠蛋白基因的区域；和(b)β-珠蛋白基因座调控区的大部分，其中包含DNA酶I超敏位点HS2、HS3和HS4。在本说明书和权利要求中，术语″重组慢病毒载体″指一种人工合成的多核苷酸载体，由一种慢病毒载体和大量的附加片段装配而成，是人类干涉和操作处理的结果。术语“功能性珠蛋白”指一种核酸序列其表达出一种不会引起血红蛋白病的珠蛋白，并且对于珠蛋白基因缺陷的个体提供治疗上的有效作用。功能性珠蛋白基因可编码一种野生型珠蛋白，适用于被治疗的哺乳动物，或者它可以是一种突变型的珠蛋白，在某一方面具有优良特性，例如较高的氧运输特性。功能性珠蛋白基因包括外显子和内含子，还有珠蛋白启动子和剪接供体/受体。合适地，珠蛋白基因可以编码α-珠蛋白、β-珠蛋白、或者γ-珠蛋白，β-珠蛋白启动子可以用于上述各珠蛋白基因。本专利技术的重组载体还包括基因座调控区(LCR)的大部分区域，该基因座调控区包含DNA酶I型超敏位点HS2、HS3和HS4。在先前的研究中，利用了HS2、HS3和HS4的核心区域的较小核酸片段。Sadelain等，Proc.Nat′l Acad.Sci.(USA)926728-6732(1995)；Lebouich等，EMBO J.133065-3076(1994)。术语“大部分区域”指转座子调控区域的一部分，其包含高度敏感位点的大部分区域，与在先研究中使用的仅仅包含核心序列的片段是不同的。该区域可以是完整的位点序列，也可以是与如下特定序列功能相同的截短的位点序列。在本专利技术优选的实施例中，基因座调控区域的大部分区域是由多个包含DNA酶I型超敏位点的片段装配而成的。另外，该基因座调控区在HS3和HS4的连接处引入两个GATA-1结合位点。虽然不能预期到是何种特定机制，但可以相信这些转录因子结合位点的引入可以加强该载体的效力。图1显示了本专利技术载体的一个实施例(TNS9)的基因组结构，TNS9合并了人β-珠蛋白基因(位于-618到+2484)，该基因包含一个延长的启动子序列和一个3′-增强子元件。任选地，可去掉慢病毒骨架的3′U3区域部分以提高安全性。在图1中，人β-珠蛋白基因的外显子和内含子表现为开放盒形式，命名为接合供体(SD)、接合受体(SA)、包装区(ψ)、反向响应元件(RRE)、人β-珠蛋白启动子(P)和′-β-珠蛋白增强子(E)。因而，在载体TNS9内，存在一个功能性8-珠蛋白基因，其同时包括该基因的外显子、内含子和人β-珠蛋白基因座相关调控序列，并与基因座调控区的大片段相连接。3.2kb的LCR被组合到dTNS9，其由840bp的HS2片段(SnaBI-BstXl)，1308bp的HS3片段(HindIII-BamHI)和1069bp的HS4片段(BamHI-BanII)组成。本专利技术的另一个方面，上述β-珠蛋白基因编码序列可以被γ珠蛋白基因(用于镰状细胞贫血症)或α珠蛋白基因(用于α地中海贫血症)替换和取代。在一个方案中，β-珠蛋白基因的NcoI-PstI片段被相应的γ珠蛋白基因片段NcoI-HindE或α珠蛋白基因片段NcoI-PstI所取代。这些片段起始于每一相应珠蛋白基因的翻译起始位点(跨越NcoI位点)，并且末端包括它们各自的多聚A(poly-A)信号。在第二个方案中，仅交换这些基因三个外显子之一的编码序列形成嵌合基因。从而，对于γ珠蛋白基因，生成如下的载体，包含β珠蛋白启动子、β珠蛋白5′非翻译区、γ外显子1编码区、γ内含子1、γ外显子2、β内含子2、γ外显子3和β3′非翻译区。因此载体TNS9的所有元件(启动子、增强子、5′和3′非翻译区、LCR元件、两个额外的GATA-1结合位点和β-珠蛋白基因的内含子(至少是最重要的内含子2))仍留在远处。在第三个方案中，修饰γ珠蛋白基因外显子3的遗传密码子，使其序列尽可能类似于β珠蛋白基因。原因在于β珠蛋白基因是最容易被表达的。本专利技术的载体还可以包括附加元件以利于该载体在治疗中的应用。如，该载体可以包括选择标记，来确定该载体是否表达，或者作为选择转化的细胞和未转化的细胞的依据，或者包括调控标记，能够使转化细胞靶向终止，从而选择性去除这样的细胞，终止治疗。在一个进一步详细的实施例中，本专利技术的载体包括鼠PGK启动子和人二氢叶酸还原酶(DHFR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述载体包括：（ａ）一个包含功能性珠蛋白基因的区域；（ｂ）β－珠蛋白基因座调控区的大部分区域，其包括完整的ＤＮＡ酶Ⅰ超敏位点ＨＳ２、ＨＳ３和ＨＳ４，当导入哺乳动物时所述载体可使β－珠蛋白在体内 表达；（ｃ）一个二氢叶酸还原酶编码区。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M沙德兰，C梅，J伯蒂诺，S莱弗拉，
申请(专利权)人：斯隆凯特林癌症研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]