本发明专利技术涉及人组织激肽释放酶，具体地说是人组织激肽释放酶的微囊化细胞及其微囊化方法和应用；在基因修饰的表达人组织激肽释放酶的细胞上包覆着具有刚性和双向流通性的包膜材料；应用于治疗高血压和／或肾脏疾病中；本发明专利技术具有如下优点：１．适于临床需要；２．适于实际应用；３．应用效果明显；４．方法确实可行。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人组织激肽释放酶，具体地说是人组织激肽释放酶的微囊化细胞及其微囊化方法和应用。
技术介绍
组织激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶家族的一员，可以裂解低分子量激肽原产生具有生物活性的激肽(文献1Clements J.A.The glandular kallikrein family ofenzymestissue-specific expression and hormonal regulation，Endocrine Rev.，1989；10393-419.；文献2Bhoola K.D.，C.D.Figueroa，K.Worthy，Bioregulationof kininskallikreins，kininogens，and kininases，Pharmacol.Rev.，1992；441-8)；激肽与B2受体结合后可以引发一系列生物学活性，如平滑肌收缩与舒张，电解质平衡，葡萄糖转运，痛觉生成，炎症形成，血管通透性增加，血压下降等(文献2Bhoola K.D.，C.D.Figueroa，K.Worthy，Bioregulation of kininskallikreins，kininogens，and kininases，Pharmacol.Rev.，1992；441-8)。临床研究发现组织激肽释放酶水平与血压水平成反相关(文献3Margolius HS，D.Horwitz，J.J.Pisano，H.R.Keiser，Urinary kallikreinexcretion in hypertensive man，Relationships tosodium intake andsodium-retaining steroids，Circ Res.，1974；35820-825)。Dahl盐敏感大鼠给予高盐负荷后，发生高血压及肾功能损伤，组织激肽释放酶可以降低Dahl大鼠的血压水平，逆转盐诱导的肾小球硬化和肾小管损伤，改善肾脏功能(文献4Willam C.Wolf，Hideaki Yoshida，Jun Agata，Lee Chao，Human tissuekallikrein gene delivery attenuates hypertension，renal injury，and cardiac remodeling inchronic renal failure，Kidney International，200058730-739)。但由于血管系统中组织激肽释放酶抑制剂的存在和蛋白酶对激肽的降解作用，为了达到治疗水平的血药浓度必须采取持续不断的给药方式(文献5Chao J，Chai K.X.，Chen L.M.，Xiong W.，Tissue kallikrein-binging protein is a serpinpurification，charaxterization，anddistribution in normotensive and spontaneously hypertensive rats，J.Biol Chem.，1990；26516394-16401)。人组织激肽释放酶在人体液中含量较低，提取纯化过程复杂，难以满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适于实际应用和临床需要的人组织激肽释放酶的微囊化细胞及其微囊化方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为基因修饰的表达人组织激肽释放酶的细胞，其上包覆着具有刚性和双向流通性的包膜材料。所述包膜材料为天然纤维海藻酸钠、多聚赖氨酸、脱乙酰几丁质、琼脂糖、聚丙烯酰胺、羧甲基纤维素钠，人造纤维，合成高聚物及其复合材料，动物皮肤或组织包膜；所述细胞通常选用小鼠成纤维细胞、成肌细胞或肾细胞；人组织激肽释放酶的微囊化细胞的微囊化方法，其过程如下1)构建组织激肽释放酶腺病毒表达载体；2)重组腺病毒Ad.CMV-cHK转染细胞；3)细胞的微囊化操作。微囊化方法中所述2)重组腺病毒Ad.CMV-cHK转染细胞具体为将0.1～1×107pfu的病毒加入到1～2×106个/mL细胞培养液中，混匀，病毒即吸附到细胞表面，进入细胞内；所述3)细胞的微囊化操作具体为挑选生长良好并高表达人组织激肽释放酶的小鼠成纤维细胞进行微囊化处理，取0.5～2×107细胞与1毫升12～16g/L海藻酸钠，充分混匀，以压缩氮气将此混合物通过针头喷洒入100mM氯化钙溶液中，形成珠状的海藻酸钠钙凝胶颗粒，收集颗粒，用分子量24kDa Sigma 0.4～0.6g/L多聚赖氨酸处理5～8分钟，再用1.3～1.5g/L海藻酸钠处理2～4分钟，生理盐水洗涤，最后用pH7.410mM柠檬酸钠液化微胶囊核心海藻酸钙，培养于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养。本专利技术将人组织激肽释放酶的微囊化细胞应用于治疗高血压和/或肾脏疾病中。所述肾脏疾病为肾损伤、肾毒性、高血压相关性肾疾病、盐诱导的肾损伤、肾小球硬化灶、肾小管损伤、药物诱发的肾损伤、慢性肾衰竭、急性肾衰竭，肾病综合征或糖尿病性肾病。本专利技术具有如下优点1.适于临床需要。本专利技术将基因工程方法构建的人组织激肽释放酶腺病毒表达载体转染到细胞内(文献6Chao J，Jin L，Chen L.M.，Chen V.C.，Chao L.Systemic and portal vein delivery of human tissue kallikrein gene reduces bloodpressure in hypertensive rats，Hum Gene Ther.，1996；7901-911)，将表达组织激肽释放酶的细胞置于特殊设计的微囊中，将微囊化细胞移植到机体组织或器官。微囊的特殊结构可以避免可能对人体有害的病毒成分与组织或器官直接接触，可以克服机体对异体组织细胞的免疫排斥作用。微囊的双向流通性可以将体液中的营养物质输送给微囊内细胞并将微囊内细胞分泌的组织激肽释放酶输送到靶组织或器官，从而起到治疗作用(文献7Tai T，Sun A.M.Microencapsulation of recombinant cellsa new delivery system for gene therapy，FASEBJ.，1993；7(11)1061-1067)。2.适于实际应用。1)本专利技术将含有人组织激肽释放酶cDNA的腺病毒载体转染小鼠成纤维细胞，使小鼠成纤维细胞稳定表达人组织激肽释放酶；2)本专利技术将表达人组织激肽释放酶的小鼠成纤维细胞进行微囊化处理，微囊对囊内细胞具有免疫隔离作用； 3)微囊包膜选用海藻酸钠，多聚赖氨酸，也可以选用天然纤维，人造纤维，合成高聚物及其复合材料，动物皮肤，组织包膜或类似物，提高了微囊膜的生物相容性和物理稳定性。3.应用效果明显。将微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞移植到高盐饮食Dahl-SS大鼠腹腔，微囊内细胞分泌组织激肽释放酶对高盐饮食Dahl-SS大鼠的血压升高，肾小球，肾小管损伤，肾功能障碍具有明显的改善作用。4.方法确实可行。1)微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞体外培养，囊内细胞呈线性生长，体外培养第1天每个微囊内细胞数为33±4，在培养第16天本文档来自技高网...
【技术保护点】
人组织激肽释放酶的微囊化细胞，其特征在于：基因修饰的表达人组织激肽释放酶的细胞，其上包覆着具有刚性和双向流通性的包膜材料。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉奎，于晓明，张维冰，杨青，徐茂兰，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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