一种与花粉发育相关的非编码ＲＮＡ的ｃＤＮＡ，其序列如下所示： １ ＴＴＧＣＧＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＡＣＧＴＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＴＴ ６１ ＧＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＣＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧ １２１ ＡＧＣＧＣＧＧＴＴＡＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＴ １８１ ＡＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＴＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡＴＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＡＣ ２４１ ＴＡＧＧＧＴＴＡＴＡＧＴＧＣＴＣＡＣＧＣＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＧＧＡＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＴＣＧＴＣＧＣＧ ３０１ ＡＧＣＴＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＣＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧ ３６１ ＴＡＧＴＧＣＴＴＡＡＴＣＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＴＡＧＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＴＡＧＡ ４２１ ＣＣＣＧＡＧＧＧＡＴＡＴＧＡＡＣＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＣＧＡＴＧＴＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＴＧ ４８１ ＴＴＣＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＣＧＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＧＡＧ ５４１ ＧＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＡＧＧＧ ６０１ ＡＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴ ６６１ ＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＡＴ ７２１ ＣＡＣＴＣＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＧＴＧＡＣＧＴＧＧＴＡＡＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＴＧＧＣＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧＴＡＡＡＣ ７８１ ＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣ ８４１ ＡＧＡＣＣＣＡＡＴＣＣＡＡＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＴＡＡＴＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡ ９０１ ＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＡＴＣＣＴＣＡＴＧＣＧＧＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡ ９６１ ＣＴＧＣＡＴＣＴＡＣＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣ １０２１ ＡＧＡＧＣＡＡＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＧＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣ １０８１ ＡＴＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＴＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡ １１４１ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子育种领域，即利用基因工程手段创造雄性不育的育种技术，具体地说，涉及一种来自于玉米花粉cDNA文库的新的非编码RNA的cDNA，它与花粉发育相关。本专利技术还涉及利用所述cDNA制备雄性不育植物的方法，尤其是制备了显示典型的花粉败育的转基因玉米和烟草。
技术介绍
杂种优势作为一种提高作物产量，改善作物品质，提高作物抗虫、抗病、抗逆的手段已被广泛的应用，并取得令人瞩目的成就，以植物雄性不育为基础的杂种优势利用已成为许多作物的育种目标，在农业生产上发挥巨大的作用。但自然出现的雄性不育类型很少存在着周期长，不育基因来源单一等问题，而且恢复系的培育和后代的筛选上也存在着一定的不足。而利用基因工程创造雄性不育的策略为杂种优势的利用克服了上述缺陷，目前采用的方法有以下几个方面1.利用花粉或花药特异表达启动子，驱动核糖核酸酶基因在花粉中特异表达，获得雄性不育植株Mariani等(1990)利用烟草花药绒毡层特异启动子TA29将核糖核酸基因导入烟草，结果核糖核酸酶特异表达能够选择性地破坏与花粉发育相关的一些器官或组织，阻断花粉发育进程，导致植物雄性不育。Paul等(1992)利用拟南芥花药绒毡层特异性启动子A9特异表达核糖核酸酶基因同样获得了雄性不育烟草植株。2.利用反义RNA技术获得雄性不育植株将Chs基因的反义基因与CaMV 35S启动子花药特异序列串联构建嵌合基因，导入矮牵牛，结果抑制了Chs合成，阻碍花粉的正常发育，从而得到了雄性不育的矮牵牛(Seymouret al.1993；Van der Krol et al，19990a，1990b；Hall et al.1993)。3.通过提早降解胼胝质壁获得雄性不育植株Hird等(1993)将与抗病性相关的β-1，3葡聚糖酶基因分别与拟南芥花粉发育早期启动子A9，A3融合，转化矮牵牛后获得不同程度的雄性不育植株。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种新的与花粉发育相关的基因，具体地说提供了一种从玉米花粉中克隆获得的与花粉发育相关的非编码RNA的cDNA，称之为ZM401。本专利技术的另一目的是提供一种利用所述基因制备雄性不育植物的新方法。本专利技术将上述基因转化植物获得了显示典型的花粉败育的转基因玉米和烟草。专利技术详述本专利技术通过差异筛选从玉米花粉cDNA文库中筛选到一个花粉特异的cDNA片段命名为zm401，它与花粉发育相关，该cDNA的序列无长的阅读框架，长度1149bp，为双链核酸类型，线性。本专利技术构建了含有所述cDNA的玉米表达载体。在一个优选的实施方式中，所述的载体包括一个表达盒，以潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记基因，编码氨基核糖苷4-磷酸转移酶APH(4)-1。所述的表达盒含有玉米花粉特异启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域。所述的表达载体优选的是重组质粒pZM401SH。本专利技术还构建了含有所述cDNA的烟草表达载体，在一个优选的实施方式中，所述质粒含有35S启动子，驱动组成型表达，所述的表达载体优选的是重组质粒pBI401F。本专利技术将上述含有所述cDNA的重组表达载体转化植物，获得了雄性不育转基因植物。在一个优选的实施方式中，将含有所述cDNA的玉米表达载体转化玉米，获得了显示典型的花粉败育的转基因玉米。在另一个优选的实施方式中，将含有所述cDNA的烟草表达载体转化烟草，获得了显示典型的花粉败育的转基因烟草。有益效果本专利技术利用获得的来自于玉米花粉cDNA文库的新的非编码RNA的cDNA，制备了显示典型的花粉败育的转基因玉米和烟草。因此利用本专利技术的cDNA可制备更多种类的雄性不育植物，这为利用基因工程手段创造雄性不育的策略为杂种优势的利用开辟了一条崭新的途径。附图简述附图说明图1表示来自玉米的非编码RNA的cDNA序列，序列特征无长的阅读框架，长度1149，类型双链核酸，拓扑线性。图2由zm401 cDNA核苷酸序列推导的氨基酸序列分析结果(*表示终止密码子)，含有多个终止子。图3表示含有玉米非编码RNA的cDNA构建过程。图4pBI401F表达载体(含0.7Kb正向cDNA)的构建方案(Constructionof expression vector pBI401F)表示含有玉米非编码RNA的cDNA的烟草表达载体构建过程。图5R0代转基因玉米(RS60.ZSg0)的Southern杂交，表型变化及花粉育性和组织学分析。A)部分转化玉米的hyg和zm401 Southern杂交结果B)转基因玉米(RS60、RS62)花药的表型分析C)转基因玉米(RS60、ZS90)花粉活力的测定D)转基因玉米(RS60、ZS90)花粉育性的观察E)转基因玉米(RS60、ZS90)花药横切—示花粉形态异常F)转基因玉米(RS60、ZS90)花药横切—示花粉发育异常、绒毡层退化延迟G)转基因玉米(RS60、ZS90)花药横切—示花粉囊发育异常左边未转化植物中间转基因植物(RS60)右边转基因植物(ZS90)图6烟草花蕾期形态学分析和双核雄配子体时期组织分析A)非转化烟草B)非转化植株双核雄配子体期绒毡层退化消失C)转ZM401正义基因的烟草D)转ZM401正义基因的烟草在双核雄配子体时期绒毡层退化延迟R0代转基因烟草的花蕾期的形态分析和双核雄配子体时期的组织学分析。具体实施例方式下面是实现本专利技术的具体实施方式。实施例1通过差异筛选从玉米花粉cDNA文库中筛选到一个花粉特异的cDNA片段，命名为zm401，用3′RACE(购自GIBCOBRL公司)和5′RACE(购自GIBCOBRL公司)获得了全长cDNA。3’RACE中所用引物 P1(21nt)5’--ATCGGGAGCGAGGAGTGGTGC--3’，NGSP2(22nt)5’--GGTGAAGCGTCAATTTATAGGG--3’，5’RACE中所用引物GSP1(18nt)5’-TAGCCATACTCCGGTGAC-3’. GSP4(25nt)5’--CTCACCGCCGTAAGCTCAATCTTGC--3’，将5′RACE和3′RACE扩增产物分别克隆到pMD18-T(购自Tatara公司)载体上，测序。用重叠PCR将分布在不同载体上的cDNA片段进行拼接。扩增产物克隆到pMD18-T载体上，测序。得到的cDNA全长为1149bp。含有poly(A)尾部，但无完整的阅读框架。该序列示于图1中，称之为zm401。重叠PCR中所用引物ZCF1(24nt)ZCF15′-TTGCGAGCACATGGACGGAGGCGC--3′ZCF2(32nt)5′--TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCACGAACCTTATAATAAAGTTGAAGCTGG--3′实施例2用于玉米中表达zm401的表达载体的构建根据已报道的玉米花粉特异表达zm13启动子的序列(Hanson DD等人(1989)，Plant Cell 1173-178，1989)设计引物ZM13PF(21nt)5′-CCAACTCAGTCCCGTTCAATC-3′；ZM13PR(21nt)5′-CGCCGGGTGAATGTACGTGTT-3′，以玉米基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将得到的片段连接到pUC-T载体(Pr本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：敖光明，于静娟，赵倩，戴晓燕，李成霞，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。