盐角草的Na /H 逆向转运蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种盐角草Ｎａ↑［＋］／Ｈ↑［＋］逆向转运蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的盐角草Ｎａ↑［＋］／Ｈ↑［＋］逆向转运蛋白来源于盐角草（Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ　　ｅｕｒｏｐａｅａ　Ｌ．），名称为ＳｅＮＨＸ１，是具有序列表中序列２氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列２的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列２的氨基酸残基序列相同活性的由序列２衍生的蛋白质。盐角草Ｎａ↑［＋］／Ｈ↑［＋］逆向转运蛋白的编码基因ＳｅＮＨＸ１，是下列核苷酸序列之一：１）序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１；２）编码序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：２蛋白质序列的多核苷酸；３）与序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的ＤＮＡ序列。本发明专利技术的基因对培育抗盐植物品种，提高农作物产量具有重要意义。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域中的一种转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及盐角草的Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
盐害是农作物产量的严重限制因素。了解植物的抗盐机理，克隆抗盐基因并转移到盐敏感的农作物中，培育抗盐的转基因作物新品种，对于有5亿多亩盐荒地的中国来说，具有十分重要的意义。植物为了抵御盐胁迫，形成了一系列的适应机制，主要是通过在细胞质中积累小分子的无毒有机溶质和离子，以及在液泡内区隔化来实现渗透平衡。高等植物细胞液泡占完全膨胀细胞总体积的95％，对于植物来说Na+是细胞生长所需要的基本营养成分，Na+的区隔化是它在盐环境中生存的必要保障。Na+/H+逆向转运蛋白(antiporter)是一种Na+的逆向转运体，在细胞质膜和液泡膜上均有分布，液泡膜上的Na+/H+antiporter将细胞质中的Na+逆着Na+浓度梯度运送到液泡中区隔化集中，细胞质膜上的Na+/H+antiporter将细胞质中的Na+逆向运送到胞外高Na+环境中，从而减少了钠离子对细胞质中细胞器的毒害，对维持细胞的渗透平衡起重要作用。植物中Na+/H+antiporter最早发现是在大麦质膜上，此后在质膜和液泡膜上均有研究报道，到目前已经在大量的盐生植物及非盐生植物中发现Na+/H+antiporter活力。已经从拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)、北滨藜(AgNHX1)、冰叶午时花(McNHX1)分离了Na+/H+antiporter基因，证明该基因的表达产物具有Na+/H+交换的功能。虽然这些基因绝大多数是从具有低逆向运输活力的甜土植物中分离的，但前人的研究表明盐生植物普遍具有在液泡中高效区隔化Na+的机制。耐盐性属于复杂性状，大量的盐胁迫反应相关基因的存在也支持这个观点。单一基因一般不能显著提高作物的耐盐水平，需要多个耐盐基因的协同作用植物才具有高耐盐性。然而转AtNhx1基因的拟南芥植株在200mM NaCl中能正常生长发育。将拟南芥的AtNhx1基因转入番茄中，过量表达液泡Na+/H+antiporter的转基因番茄在200mM NaCl胁迫下能够正常生长、开花和结实。尽管叶片中Na+浓度高，但番茄果实中Na+浓度很低。说明转Na+/H+antiporter单基因能够明显提高植物耐盐性，同时，具有器官表达的特异性，有力支持了Na+/H+antiporter在植物耐盐性方面所具有的重要作用。盐角草是世界上最耐盐的盐生植物，同时是一种最有潜力发展为新型作物的盐生植物，在我国有较广泛的分布，可以在高于海水盐度的条件下正常生长。植物体多汁和肉质化，食之可发现具有很重的咸味，说明植物体蓄盐量高。盐角草这些超乎寻常的耐盐特性表明在该植物中无疑存在极其高效的Na+逆向运输和储存机制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供盐角草Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因。本专利技术所提供的盐角草Na+/H+逆向转运蛋白来源于盐角草(Salicorniaeuropaea L.)，名称为SeNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。序列表中序列2氨基酸残基序列是由560个氨基酸残基组成的蛋白质。根据GenBank中Na+/H+逆向转运蛋白保守的氨基酸序列设计合成了2个简并性引物，P15′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；P2 5′-(C/T)TCAT(A/G)AgACCAgCCCACCA-3′，通过RT-PCR及RACE方法从盐生植物盐角草中克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因。盐角草Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因SeNHX1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由2668bp个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第492位到第2174位碱基。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的编码盐角草Na+/H+逆向转运蛋白SeNHX1的基因导入植物细胞，可获得对高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。本专利技术的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，Ubiqutin启动子，增强子既可以是转录增强子，也可以是翻译增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本专利技术盐角草Na+/H+逆向转运蛋白SeNHX1基因的表达载体可以是Ti(Tu mor-induced-癌诱导)质粒、Ri(Root-induced-根诱导)质粒、植物病毒载体等，转化可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物技术方法实现，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻，小麦，玉米，大豆，棉花，蔬菜，树木和草坪草等。本专利技术的基因对培育抗盐植物品种，提高农作物产量具有重要意义。附图说明图1为Na+/H+逆向转运蛋白cDNA克隆图2为盐角草(SeNHX1)疏水性分析图3为植物Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的同源性比较图4为盐角草Na+/H+逆向转运蛋白的系统发育树分析图5为盐角草基因组DNA的Southern杂交分析具体实施方式实施例1、RNA和DNA的分离用Trizol试剂盒(GIBCO-BRL)从盐角草(Salicornia europaea L.)幼苗中提取RNA，随后用无Rnase的DNase(TaKara)除去RNA中残留的DNA。DNA提取采用CTAB方法。实施列2、盐角草Na+/H+逆向转运蛋白cDNA片段的分离根据北滨藜、碱蓬、柑桔中Na+/H+逆向转运蛋白保守的氨基酸序列合成简并性引物P15′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；P2 5′-(C/T)TCAT(A/G)AgACCAgCCCACCA-3′。为了分离cDNA片段，用逆转录试剂盒(Promega)根据盐角草的RNA合成第一链cDNA。用合成的第一链cDNA作为模板，进行RT-PCR。RT-PCR反应混合物为25μl，含有2μl cDNA模板，0.8mmol/L dNTPs，每条引物0.6μmol/L，1×PCR缓冲液，1U Taq DNA polymerase(Promega)。PCR反应程序95℃，4min；95℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 1min，共36个循环；72℃ 10min。得到一个700bp的cDNA片段如图1中的(b)所示。将其与PGEM T-easy vector连接，转化大肠杆菌DH5α，利用蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，提质粒，NotI酶切质粒鉴定插有预期大小片段(700bp)的阳性克隆，进行测序。测序结果表明，获得了725bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
盐角草Ｎａ↑［＋］／Ｈ↑［＋］逆向转运蛋白ＳｅＮＨＸ１，是具有序列表中序列２氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列２的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列２的氨基酸残基序列相同活性的由序列２衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李银心，吕慧颖，陈华，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]