干扰素r多肽变体制造技术

本发明专利技术涉及具有干扰素γ（ＩＦＮＧ）活性的新的干扰素γ多肽变体，其制备方法，含有该多肽变体的药物组合物及其在疾病治疗中的用途，尤其是在治疗间质性肺疾病，如自发性肺纤维化中的用途。这些新的多肽变体与ｈｕＩＦＮＧ的氨基酸序列或其片段相比，全都包含Ｓ９９Ｔ取代。该突变导致第９７位的天然Ｎ－糖基化位点得到显著更好的利用。优选地，所述变体包含其它修饰，例如，当皮下给药时可增加所述变体的ＡＵＣ。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有干扰素γ(IFNG)活性的新的干扰素γ多肽变体，其制备方法，含有该多肽变体的药物组合物及其在疾病治疗中的用途，尤其是在治疗间质性肺疾病，如自发性肺纤维化中的用途。
技术介绍
干扰素-γ(IFNG)是由T-淋巴细胞和天然杀伤细胞产生的一种细胞因子且以两个非共价结合的多肽亚基的同型二聚体存在。每一二聚体的成熟形式含有143个氨基酸残基(SEQ ID NO 2所示)，其前体形式包括166个氨基酸残基的信号序列(SEQ ID NO 1所示)。各亚基具有两个潜在的N-糖基化位点(Aggarwal等，人类细胞因子，Blackwell科学出版社，1992)在位置25和97。根据糖基化的程度，二聚体形式的IFNG分子量是34-50kDa(Farrar等，免疫学年鉴，1993，11571-611)。Gray等(自然，298859-863，1982)，Taya等(EMBO J.1953-958，1982)，Devos等(核酸研究，102487-2501，1982)和Rinderknecht等(生物学化学杂志，2596790-6797，1984)及在EP 77670，EP 89676和EP 110044中已报导了野生型人IFNG(huIFNG)的一级序列。Ealick等(科学，252698-702，1991)报导了huIFNG的三维结构。已报导了IFNG亚基多肽的各种天然存在的或突变的形式，包括一种包含Cys-Tyr-Cys N-末端氨基酸序列(相对于SEQ ID NO 17的位置(-3)-(-1))的形式，一种包含N-末端甲硫氨酸(相对于SEQ ID NO 17的位置-1)的形式，和含有127-134氨基酸残基的各种C-末端截短形式。已知可从C-末端缺失1-15个氨基酸残基而不破坏该分子的IFNG活性。而且，Pan等(欧洲生物化学杂志，166145-149，1987)已描述了huIFNG C-末端的异质性。Slodowski等(欧洲生物学化学杂志，2021133-1140，1991)，Luk等(生物学化学杂志，26513314-13319，1990)，Seelig等，(生物化学，271981-1987，1988)，Trousdale等(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，261244-1251，1985)，和在EP 146354中报导了HuIFNG突变蛋白。Nishi等(生物化学杂志，97153-159，1985)报导了天然huIFNG变体。US 6,046,034公开了插入4对半胱氨酸残基使得二硫键形成且因此以同型二聚体的形式稳定IFNG变体的耐热重组huIFNG(rhuIFNG)变体。WO 92/08737公开了在野生型人IFNG的全长(残基1-143)或部分(残基1-132)氨基酸序列的N末端含有添加的甲硫氨酸的IFNG变体。EP 219781公开了含有氨基酸残基3-124(SEQ ID NO 17中)的部分huIFNG序列。US4,832,959公开了含有氨基酸序列的残基1-127，5-146和5-127的部分huIFNG序列，该序列与SEQ ID NO 2相比具有3个添加的N-末端氨基酸残基(CYC)。US 5,004,689公开了编码无3个N-末端氨基酸残基CYC的huIFNG的DNA序列及其在大肠杆菌中的表达。EP 446582公开了大肠杆菌产生的不含N-末端甲硫氨酸的rhuIFNG。US 6,120,762公开了含有其残基95-134(相对于SEQ ID NO 18)的huIFNG肽片段。Wang等(Sci.Sin.B 241076-1084，1994)报导了rhuIFNG的高水平表达。Curling等(生物化学杂志，272333-337，1990)和Hooker等，(干扰素和细胞因子研究杂志，1998，18287-295)报导了rhuIFNG中的糖基化变体。Kita等(Drug Des.Deliv.，6157-167，1990)，和在EP 236987和US5109120中报导了rhuIFNG的聚合物修饰。WO 92/22310报导了干扰素，特别是huIFNG的脱唾液酸糖蛋白偶联物的衍生物。IFNG融合蛋白已有描述。例如，EP 237019公开了具有表现出干扰素β活性的区域和一个表现出IFNG活性的区域的单链多肽。EP 0158198公开了具有表现出IFNG活性的区域和表现出IL-2活性的区域的单链多肽。一些文献描述了单链二聚体IFNG蛋白质，例如Landar等(分子生物学杂志，2000，299169-179)。WO 99/02710公开了单链多肽，其中的一个例子是IFNG。WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的PEG连接的变体，其中，位于多肽特定区域的一个非必需氨基酸残基被一个半胱氨酸残基取代。IFNG作为生长激素超家族成员的一个例子被提及，但没有详细讨论其修饰。已有建议将IFNG用于治疗间质性肺疾病(也称为间质性肺纤维症(IPF))(Ziesche等(新英格兰医学杂志，3411264-1269，1999和胸科，110增刊25S，1996)和EP 795332)，为此可将IFNG与脱氢皮质甾醇结合使用。除了IPF外，肉芽肿性疾病(Bolinger等，临床药物学，1992，11834-850)，某些分支杆菌感染(新英格兰医学杂志，3301348-1355，1994)，肾癌(泌尿学杂志，152841-845，1994)，石骨症(新英格兰医学杂志，3321594-1599，1995)，硬皮病(风湿病学杂志，23654-658，1996)，乙型肝炎(肝胃肠学，452282-2294，1998)，丙型肝炎(国际肝学通信，6264-273，1997)，脓毒性休克(自然医学，3678-681，1997)和类风湿性关节炎也可用IFNG治疗。作为药用化合物，rhuIFNG被用于，例如抵抗某些病毒感染和肿瘤取得了一定的成功。rhuIFNG通常经过肠胃外使用，优选通过皮下，注射使用。7小时后发现最大血清浓度，血浆半寿期是在静脉注射给药后30分钟。因此用rhuIFNG进行有效治疗需要经常注射。主要的有害作用包括发烧，寒战，出汗，头痛，肌痛和嗜睡。这些效应与注射rhuIFNG相联系且在注射后第一个小时内观察到。罕见的副作用是局部疼痛和红斑，肝脏酶升高，可逆的粒细胞和血小板减少症及心脏毒性。WO 01/36001公开了新的IFNG偶联物，它包含与IFNG多肽相连的非多肽组分，其中所述的IFNG多肽通过引入和/或删除针对上述非多肽组分(如PEG)的连接位点和糖基化位点而被修饰。众所周知，当N-糖基化分子(如IFNG)在糖基化宿主中产生时，并非所有潜在的糖基化位点都被利用。这意味着常常获得具有不同程度的体内N-糖基化的蛋白混合物，导致必需随后进行纯化。而且，分离具有不同的糖基化程度的相同蛋白常常是耗时且棘手的。现在意外发现，通过取代体内N-糖基化位点(无论所述体内N-糖基化位点是IFNG中的天然位点还是如WO 01/36001所述的引入的体内N-糖基化位点)附近的一或多个氨基酸残基，有可能促进对完整糖基化IFNG分子的分级分离。尤其是发现，将hIFNG中第97，98本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有ＩＦＮＧ活性并具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示氨基酸序列的干扰素γ（ＩＦＮＧ）多肽变体，或其具有ＩＦＮＧ活性的片段。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：安妮D詹森，
申请(专利权)人：马克西根控股公司，
类型：发明
国别省市：KY[开曼群岛]