细胞抑制剂及其晶形的发酵制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于浓缩培养基中的爱泼斯龙的方法，一种用于生产爱泼斯龙的方法，一种用于分离爱泼斯龙Ａ和Ｂ的方法与通过针对爱泼斯龙的生产通过诱变获得的菌株，以及与其有关的方面。还描述了爱泼斯龙Ｂ的晶形。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为1999年2月17日、申请号为99803121.6、专利技术名称为“”的申请的分案申请。本专利技术涉及一种可以以工业规模用于生产爱泼斯龙的新的生物技术制备方法，尤其是一种用于浓缩培养基中的这些化合物的方法，以及用于发酵制备这些化合物的新的菌株。本专利技术还涉及可以由所述新方法获得的爱泼斯龙的新晶形、尤其是爱泼斯龙B的新晶形，其在生产药物制剂中的用途，包括这些新晶形的新的药物制剂和/或这些化合物在治疗如肿瘤之类的增殖性疾病中或者在生产适合于这种治疗的药物制剂中的用途。
技术介绍
在现存的用于治疗肿瘤的细胞毒性活性成分中，紫杉醇_(Taxol_)(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb)—一种微管稳定剂起到了重要的作用并且取得了显著的商业上的成功。但是，紫杉醇具有许多缺点。具体地讲，其在水中的溶解性极差便是一个问题。因而变得必须于含有Cremophor EL_(聚氧乙基化蓖麻油；BASF，Ludwigshafen，德国)的制剂中的紫杉醇_给药。Cremophor EL_具有严重的副作用；例如它导致过敏反应，其中至少在一个病例中甚至已经导致病人的死亡。尽管已将紫杉烷类微管稳定抗癌剂称赞为“可能是近十年来在抵抗癌症的药物装备中最重要的补充”(参见Rowinsky E.K.《医学年度回顾》48，353-374(1997))，并且尽管紫杉醇_在商业上的成功，但是这些化合物似乎仍然不能代表在癌症化疗中真正的巨大的突破。采用紫杉醇_的治疗与一系列明显的副作用有关，并且许多原发性致密肿瘤(即结肠和前列腺肿瘤)对该化合物仅仅产生很小程度的响应(特别参见Rowinsky E.K.)。此外，通过获得抗性机制可以损害、甚至可以完全中和紫杉醇的功效，尤其是那些基于磷蛋白超量表达的过程，其起到了活性成分的流出泵的作用，诸如由于多药物转运糖蛋白“P-糖蛋白”的超量表达导致的“多药物抗性”。爱泼斯龙(epothilone)A和B代表具有下列通式的一类新的微管稳定细胞毒性活性成分(参见Gerth，K.等人《抗生素杂志》49，560-3(1966)) 其中R表示氢(爱泼斯龙A)或甲基(爱泼斯龙B)。与紫杉醇_相比，这些化合物具有下列优点a)它们具有更好的水溶性，因而更易于制剂使用；b)据报道在细胞培养实验中，它们对于抵御细胞的增殖同样具有活性，其中这些细胞由于使它们具有“多药物抗性”的P-糖蛋白流出泵的活性，显示出对采用包括紫杉醇_在内的其它化疗剂治疗的抗性(参见Bolag，D.M.等人“爱泼斯龙s，一类新的具有类似于紫杉醇作用机制的微管稳定剂”《癌症研究》55，2325-33(1995))；以及c)可以表明在体外它们对带有修饰的β-微管蛋白的紫杉醇_-抗性卵巢癌细胞系仍然非常有效(参见Kowalski，R.J.等人《生物化学杂志》272(4)，2534-2541(1997))。爱泼斯龙的药物应用方式(例如用于肿瘤的治疗)可能类似于针对紫杉醇所述的方式，例如参见US 5.641.803；US 5.496.804；US5.565.478。为了出于制药的目的能够大规模地使用爱泼斯龙，那么必须获得合适数量的这些化合物。迄今为止，在文献中描述了通过粘细菌提取天然物质，尤其是来自于细胞菌株纤维堆囊菌Soce90(在德国微生物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms)以编号6773保藏，参见WO93/10121)的爱泼斯龙。为了获得令人满意的浓度的天然物质、尤其是爱泼斯龙，在用于随后提取的培养基中，总是事先加入以聚苯乙烯为基础的吸附树脂，例如Amberlite XAD-1180(Rohm & Haas，法兰克福，德国)。但是，该方法的缺点为在以大规模生产时，它带来了大量的问题。树脂球损害了阀门，管道堵塞，由于机械摩擦设备可能经历更多的磨损。树脂球是多孔的，因而具有大的内表面积(约为825m2/克树脂)。由于封闭在树脂中的空气不被高压灭菌，因此灭菌成为一个问题。于是，当采用树脂添加时，实际上不能大规模地实现该方法。另一方面，在不添加树脂球时，在培养基中不能实现令人满意的浓度的爱泼斯龙。令人吃惊的是现已发现找到一条摆脱这一困境的方法的需要，它可以使得在不添加树脂的情况下从微生物(特别是粘细菌)中获得令人满意的浓度的天然物质，其中所述的微生物在培养基中产生如爱泼斯龙A或B之类的爱泼斯龙(特别是一定浓度的爱泼斯龙A和B)，于是可以使得在没有上述缺点的情况下以技术和工业规模实现这些化合物(尤其是爱泼斯龙)的生产。专利技术的详细描述为了以生物技术的规模生产以下这些化合物，本专利技术一方面涉及一种用于浓缩培养基中的爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B，特别是爱泼斯龙B)的方法，该方法包括产生这些化合物的微生物(尤其是粘细菌(作为天然物质的生产者))、并从而将在培养基中可溶的复合物形成成分加入所述培养基中。再一方面涉及相应的培养基，所述培养基包括相应的复合物形成成分以及适于生产爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B)的微生物，所述微生物尤其是粘细菌、特别是堆囊菌属的微生物。本专利技术再一方面涉及一种用于生产爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B，尤其是两种纯的化合物，特别是爱泼斯龙B)的方法，其特征在于通过处理用于生物技术制备这些化合物的培养基，其中所述的培养基包括作为天然物质生产者的产生这些化合物的微生物(尤其是粘细菌)以及向其中加入在培养基中可溶的复合物形成成分，以及接下来进行纯化来获得爱泼斯龙，并且如果需要的话，分离爱泼斯龙(例如爱泼斯龙A和B)。本专利技术第四方面涉及一种分离爱泼斯龙的方法，尤其是使爱泼斯龙A和B彼此分离的方法，其特征在于在反相柱中用包括低级烷基氰的洗脱液进行的层析。本专利技术再一方面涉及一种通过诱变获得的纤维堆囊菌的菌株，所述菌株在其它都相同的条件下比纤维堆囊菌Soce90生产出更多的爱泼斯龙。再一方面还涉及爱泼斯龙B的新的晶形。本文以上和以下所使用的常用术语优选具有以下给出的含义当本文以上和以下提到参考文献时，当有需要时这些文献插入本文。词头“低级”总是表示相应命名的基团含有优选最大值为7个的碳原子，特别是至多4个的碳原子，并且是支链或直链的。低级烷基例如可以是直链或支链的一个或多个基团，并且例如为甲基、乙基、如异丙基或正丙基这样的丙基、如异丁基、仲丁基、叔丁基或正丁基这样的丁基或者还有如戊基或正戊基这样的戊基。用于生物技术制备爱泼斯龙的含有生产这些化合物的微生物(作为天然物质的生产者，尤其是粘细菌)的培养基主要为这样的一种培养基，所述培养基包括相应的(天然存在的或者也可以通过培养或特别是通过遗传修饰获得的)微生物〔尤其是在某种情况下产生这些化合物的粘细菌的菌株，特别是堆囊菌属的粘细菌，优选(特别是对爱泼斯龙的生产而言)纤维堆囊菌Soce90类型的微生物(参见WO93/10121)，或者由此(例如通过诱变或重组基因技术)或由该粘细菌的部分衍生的生物材料，尤其是相应衍生的菌株，特别是具有参考号为BCE33/10的菌株或其突变株〕和水以及此外优选的培养基的其它的常规和合适的成分〔诸如生物聚合物，糖，氨基酸，盐，核酸，维生素，抗生素，化学信息素，生长基质，来自如酵母这样的生物材料的提取物或其它的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使爱泼斯龙彼此分离的方法，尤其是使爱泼斯龙Ａ和Ｂ彼此分离的方法，其特征在于在反相柱中用含有低级烷基氰的洗脱液进行的层析。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H霍夫曼，M马恩克，K麦莫特，F彼特森，T舒普，E库斯特斯，M穆兹，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]