本发明专利技术涉及重组人睫状神经营养因子在制备成人多能肌肉干细胞中的应用。发明专利技术人通过实验证明了重组人睫状神经营养因子的一种新的生物学作用，能诱导生成一种具有体外多能分化能力的成人肌肉干细胞。发明专利技术人观察到体外培养时给予高浓度人睫状神经营养因子或转染分泌型人睫状神经营养因子都可诱导成人成肌细胞生成一种新的多能肌肉干细胞。这一发明专利技术可为包括多种组织损伤和临床退行性疾病的治疗提供新的自体干细胞来源，具有较广阔的市场前景。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组人睫状神经营养因子的一种新的生物学应用，具体为利用重组人睫状神经营养因子诱导生成一种具有体外多能分化能力的成人肌肉干细胞。
技术介绍
成年个体肌肉中存在着的成肌细胞是单能分化的肌肉干细胞。可以通过表达特异的成肌调节因子myf5、MyoD、myogenin和MRF4调节成肌细胞的成肌分化并最终形成肌管肌纤维，其中myf5和MyoD决定成肌细胞定向成肌分化，而myogenin和MRF4则促进成肌细胞终末分化为肌管肌纤维(SealeP and Rudnicki MA.A new look at the origin，function，and“stem cell”atatus ofmuscle satellite cells.Develop Bio，2000，218115-124)。就成肌细胞本身而言，并不具备向其它组织类型细胞分化的能力。睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)是神经生长因子家族以外的一种神经营养因子，其主要生物学作用是支持神经细胞的存活。CNTF可使胚胎干细胞保持在未分化的干细胞状态(Conover JC，Ip NY，Poueymirou WT，et al.Ciliary neurotrophic factor maintains the pluripotentialityof embryonic stem cells.Development，1993，119559-565)，也能抑制神经干细胞的分化并促进其自我更新(Shimazaki T，Shingo T and Weiss S.The ciliaryneurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp 130 receptor complex operates inthe maintenance of mammalian forebrain neural stem cells.JNeurosci，2001，21(19)7642-7653)。有关CNTF对成肌细胞直接作用的报道较少，仅邓小华等(邓小华，侍坚，蒋春雷，等.睫状神经营养因子对体外骨骼肌细胞的促增殖作用.中国应用生理学杂志，2000，16(1)59-63)报道增加外源性CNTF含量能促进L6-TG肌母细胞和新生SD大鼠原代成肌细胞的体外增殖。但迄今未见有关重组人睫状神经营养因子诱导生成一种具有体外多能分化能力的成人肌肉干细胞的报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人通过实验证明了hCNTF能诱导成人肌肉干细胞生成一种具有体外多能分化能力的成人肌肉干细胞的作用。本专利技术中的含hCNTF的真核表达载体是通过以下步骤获得的制备hCNTF基因片段，与真核表达质粒连接，构建含hCNTF的真核表达载体。首先进行成人成肌细胞的分离和单克隆扩增。从成人胸小肌取样，经消化酶液消化等处理后接种细胞于培养瓶中，然后采用有限稀释法接种细胞到96孔板，挑选Desmin+单个细胞，进行单克隆扩增，每株克隆传代≥25代。将单克隆细胞进行Desmin染色鉴定，Desmin+率约为1 00％。这些细胞在分化液中培养后形成肌管，经免疫细胞化学染色鉴定表明myosin呈均一阳性。可见从成人胸小肌来源的成肌细胞能形成单克隆细胞株，且传25代以上能保持其表型不变。CNTF是一种细胞外活性因子，而所有的哺乳类CNTF均缺乏导致分泌的N末端疏水引导序列，因此在转染CNTF的COS7，Hela或其它任何真核细胞的培养基中都不能检测到被分泌的CNTF。由于CNTF在培养液中易于失活，专利技术人在观察高浓度外源性CNTF对分离的成人肌肉干细胞作用的同时，将含或不含信号肽序列的s-hCNTF or hCNTF DNA片段连接到真核表达载体，制备了含rhCNTF的可分泌型表达载体和不可分泌型表达载体。转染Desmin+单克隆细胞，使rhCNTF在Desmin+单克隆细胞中瞬时表达。ELISA法测定培养液中rhCNTF蛋白的表达水平。ELISA分析表明，rhCNTF在转染分泌型表达载体的成肌细胞中被特异表达并能够分泌到培养基中，在局部产生较高的作用浓度。分离Desmin+的单克隆成人成肌细胞，给予高浓度CNTF或转染分泌型表达质粒处理后，专利技术人在培养细胞中分离出呈小圆球形的、Desmin-和Nestin+表型的、未见报道的肌肉干细胞。单克隆培养这些肌肉干细胞，并在悬浮态下传代25代以上获得表型稳定的单克隆株。当诱导其多能分化时，这些克隆化的肌肉干细胞能分化产生表达NF160、NSE、TH和chAT蛋白的神经元以及胶质细胞、平滑肌和脂肪细胞。因此，体外培养时给予高浓度CNTF或转染分泌型CNTF可诱导成人成肌细胞生成一种新的多能肌肉干细胞。本专利技术可为包括多种组织损伤和临床退行性疾病的治疗提供新的自体干细胞来源。附图说明图1pcDNA3-s-hCNTF重组表达质粒的构建图2pGEM-3-zf(+)-s-hCNTF的测序3重组表达质粒pcDNA3-s-hCNTF的酶切电泳图ApcDNA3-s-hCNTF KpnI+ApaI双酶切BpcDNA3-s-hCNTF KpnI+BamI双酶切CpcDNA3-s-hCNTF的HindIII单酶切MDNA/EcoRI+HindIII双酶切的DNA标准图4成肌细胞单克隆及其鉴定.单个成肌细胞(a)及其克隆(d)。这些克隆化细胞被分散接种在盖玻片上12h(b)or诱导分化72h(e)，并分别用Desmin(c)或Myosin(f)进行免疫组化鉴定，结果表明生长12h or诱导分化72h的细胞对Desmin或Myosin的反应呈均一阳性。图5分泌型rhCNTF的表达.转染pcDNA3(P)，pcDNA3-CNTF(PC)和pcDNA3-s-CNTF(PSC)质粒的培养液在转染诱导分化后0-3d被收集并浓缩10倍，采用hCNTF ELISA Kit(R&D system)分析分泌型rhCNTF在培养液中的表达量。p＜0.05，n＝3。图6分泌型rhCNTF抑制成肌细胞的体外分化. A转染pcDNA3(P)，pcDNA3-CNTF(PC)和pcDNA3-s-CNTF(PSC)质粒的细胞被诱导分化72h的相差显微镜照相。可见转染pcDNA3-s-CNTF的细胞中肌管，数量显著减少，且有折光度强的小圆球形细胞生成。B肌细胞的分化用融合率表示，融合率在转染pcDNA3-s-CNTF的细胞中显著降低。*p＜0.05，n＝5。图7成肌细胞(MB)和被转化成肌细胞(CM)的鉴定. A单个CM(a)及其单克隆(b)，以及悬浮扩增的CM(c)。B克隆化的CM细胞接种在盖玻片上12h后，Desmin，Vimentin，Nestin，和CD34免疫细胞化学鉴定。CWestern blot检测MB和CM细胞中myf5和MyoD的表达。图8CM细胞的多能分化. ACM培养在DM1中14-20days，然后进行NF160，TH，NES和chAT免疫细胞化学染色。BCM培养在DM2中10-14days，然后进行CNPase和免疫细胞化学染色。CCM CM培养在DM3中15-20days，然后进行SMA和Oil 本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组人睫状神经营养因子在制备成人多能肌肉干细胞中的用途。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓萍，范明，刘红，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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