抗原特异性细胞毒性T细胞的扩大培养方法技术

本发明专利技术提供诱导具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性Ｔ细胞的方法，维持该细胞的方法，连续培养该细胞的方法，扩大培养该细胞的方法，所述方法包括在选自（Ａ）－（Ｅ）的至少一种物质存在下培养细胞毒性Ｔ细胞的步骤：（Ａ）具有ＣＤ４４结合活性的物质；（Ｂ）能调控由ＣＤ４４配体与ＣＤ４４结合而激发的信号的物质；（Ｃ）能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质；（Ｄ）能调控由生长因子与生长因子受体结合而激发的信号的物质；（Ｅ）纤粘连蛋白、其片断或它们的混合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及诱导、维持及扩大培养(expanding)医疗领域中有用的具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法。
技术介绍
活的生命体主要通过免疫应答排除异物，而免疫系统由各式各样的细胞及其产生的可溶性因子构成。其中起关键作用的为白细胞，尤其是淋巴细胞。淋巴细胞主要分为B淋巴细胞(以后称作B细胞)和T淋巴细胞(以后称作T细胞)两种，二者均能特异性识别抗原，与之作用，从而保护生命体。T细胞分为具有CD(Cluster Designation)4标志，主要与辅助抗体的产生和诱导各种免疫应答有关的辅助性T细胞(TH)，以及具有CD8标志，主要显示细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞(Tc，细胞毒性T淋巴细胞，亦叫做杀伤性T细胞，以后记作CTL)两个亚类。CTL对识别、破坏、消除肿瘤细胞和病毒感染的细胞等起着最重要的作用，它不像B细胞那样对抗原产生特异性反应，产生抗体，而是直接识别并作用于与靶细胞膜表面上的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC；在人类中也称作人白细胞抗原(HLA))I类分子结合的靶细胞来源的抗原(抗原肽)。该情况下，CTL膜表面的T细胞受体(以后称作TCR)特异性识别前面所述的抗原肽及MHC I类分子，判断抗原肽是自身来源的还是非自身来源的。所判断出的非自身来源的靶细胞就被CTL特异性破坏、除去。近年来，人们开始重新看待如药物疗法和放射疗法这样对患者造成沉重的身体负担的治疗方法，提高了对减轻患者身体负担的免疫治疗方法的关注。尤其是使来源于免疫功能正常的人的CTL或T细胞体外(in vitro)诱导产生对抗原产生特异性反应的CTL后，将其移入患者的免疫过继疗法(adoptive immunotherapy)的有效性备受瞩目。例如，应用动物模型显示免疫过继疗法对病毒感染及肿瘤是有效的治疗方法。再者，基于给免疫缺陷患者施用CTL能导致快速且持续地消除巨细胞病毒而不显现毒性的特异性CTL应答的重构，将CTL应用于先天性、后天性及医原性T细胞免疫功能不全患者也受到关注。这种治疗方法，要在维持或增强CTL的抗原特异性细胞杀伤活性的状态下进行，所以维持或增加其细胞数目非常重要。对于维持或增加CTL的细胞数而言，根据动物模型的研究可推算在人类的免疫过继疗法中所需的有效细胞数，109-1010个抗原特异性T细胞是必须的(Greenberg，P.D.著，Advances in Immunology，1992年出版)。也就是说，免疫过继疗法中最大的问题是短时间内在体外获得这些数目的细胞。对于维持或增强CTL的抗原特异性细胞杀伤活性而言，诱导CTL的抗原特异性应答时，一般的方法是用目的抗原反复刺激。但是，该方法有时暂时地增加细胞数目，而最终细胞数减少，得不到必要的细胞数目。目前，相应的对策只有在反复进行抗原刺激的初期阶段冻存细胞，或克隆到抗原特异性CTL克隆，冻存一部分后，当长期培养过程中出现细胞数或抗原特异性杀伤活性降低时，融解冻存的细胞，再度进行抗原刺激。应用小鼠T细胞进行长期培养来建立T细胞的方法已有报道，该方法是分离T细胞建株的方法，它不能使T细胞增殖到109-1010个细胞。美国专利第5057423号中公开了大量使用高浓度的白细胞介素2(IL-2)诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，3-4天使细胞增加100倍的方法。考虑到通常1个细胞分裂生成2个细胞大约需24小时，细胞数发生了飞跃式变化。另外，尝试了应用同样高浓度的IL-2诱导肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继性免疫疗法。但是，前者是抗原非特异性T细胞的获得方法，后者由于应用了活化的多克隆的淋巴细胞群，所以即便有特异性也是有限的。况且，上述方法中均为了促进细胞增殖而应用了高浓度的IL-2。有报道说用高浓度的IL-2处理过的T细胞在IL-2不存在的情况下接受特异性抗原刺激时，有时会引起细胞凋亡(细胞死亡)。所以，上述方法中所得LAK细胞或TIL的有效性是有问题的。用T细胞生长因子和IL-2以低密度(5×103-1×104个/ml)培养T细胞，经过7天，细胞可快速增殖，最终增殖到细胞数达3-5×105个/ml的饱和密度。但是，有报道说，细胞一旦达到饱和密度，通常会死亡。因此，LAK细胞、TIL及低密度的T细胞培养方法，无论是实用性还是有用性均存在问题。关于抗原特异性CTL的报道有，体外培养同种异体的巨细胞病毒(CMV)特异性的CTL 5-12周，使CTL增殖后，静脉内施用给免疫功能不全的患者的过继性免疫疗法；用自身CMV感染成纤维细胞和IL-2及用抗CD3单克隆抗体(抗CD3mAb)和IL-2分离及大量培养CMV特异的CTL克隆的方法。但是，这些方法存在大的问题。即，获得1×109个/ml的抗原特异性CTL大约需要3个月，其间患者的症状仍在发展，很难按照患者状况进行处理。作为解决这些问题的方法，WO96/06929公开了REM法(Rapidexpansion method)。REM法是短期内增殖(expand)包含抗原特异性CTL和TH的T细胞初期群的方法。该方法的特征在于使各T细胞克隆增殖，提供大量的T细胞，但存在如下的问题。在REM方法中，应用抗CD3抗体、IL-2及经放射线照射而不增殖的PBMC(外周血单核细胞)和非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr virus，以后略作EBV)感染的细胞使抗原特异性CTL数目增殖，然而存在如下问题不能排除T细胞内混入EBV转染的B细胞(EBV-B细胞)(安全性问题)；有必要使用大量的PBMC(必要时至少约为抗原特异性CTL数的40倍)作为饲养细胞(feeder cell)；所增殖的CTL的抗原特异性细胞杀伤活性不能充分满足要求；应用T细胞克隆以外的T细胞群进行增殖时，T细胞具有的抗原特异性杀伤活性与细胞的增殖一起降低等。也就是说，目前存在的抗原特异性CTL的制备方法，其现状是，短期内制备足量有效的用于治疗的具有抗原特异性细胞杀伤活性的CTL这样的过继性免疫疗法中，必要的不可欠缺的问题尚未解决。专利技术公开本专利技术的目的是提供诱导、维持及扩大培养适用于过继性免疫疗法的保持高水平抗原特异性细胞杀伤活性的CTL的方法，即本专利技术涉及(1)一种诱导具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，该方法包括在选自下面(A)-(E)的至少一种物质存在下，将具有细胞毒性T细胞分化能力的前体细胞与抗原呈递细胞一起培养的步骤(A)具有CD44结合活性的物质；(B)能调控由CD44配体与CD44结合而激发的信号的物质；(C)能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质；(D)能调控由生长因子与生长因子受体结合而激发的信号的物质；(E)纤粘连蛋白、其片断或它们的混合物；(2)上面(1)的方法，其中具有CD44结合活性的物质为CD44配体和/或抗CD44抗体；(3)上面(2)的方法，其中CD44配体为透明质酸；(4)上面(1)的方法，其中能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质为具有生长因子结合活性的物质；(5)上面(4)的方法，其中具有生长因子结合活性的物质为抗生长因子抗体； (6)上面(1)、(4)和(5)任一项的方法，其中生长因子为选自肝细胞生长因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性Ｔ细胞的方法，其特征在于，该方法包括在选自下面（Ａ）－（Ｅ）的至少一种物质存在下，将具有细胞毒性Ｔ细胞分化能力的前体细胞与抗原呈递细胞一起培养的步骤：（Ａ）具有ＣＤ４４结合活性的物质；（Ｂ）能调控由ＣＤ４４配体与ＣＤ４４结合而激发的信号的物质；（Ｃ）能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质；（Ｄ）能调控由生长因子与生长因子受体结合而激发的信号的物质；（Ｅ）纤粘连蛋白、其片断或它们的混合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：佐川裕章，出野美津子，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]