从人造血干细胞分化的CD8α*淋巴树突细胞和分化方法技术

用一种方法可以生产具有ＣＤ８α↑［＋］免疫表型的淋巴树突细胞，该方法包括在含有ＧＭ－ＣＳＦ的培养基中培养人造血干细胞，接着在含有ＩＦＮ－γ的培养基中培养，所述细胞用于多种免疫疗法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从人造血干细胞分化的淋巴树突细胞，从人造血干细胞分化淋巴树突细胞的方法和用于免疫治疗，含有作为活性成分的淋巴树突细胞的药物组合物。
技术介绍
树突细胞(DC)是强有力的抗原呈递细胞(APC)，其协调针对特定抗原的各种免疫反应，并且通过除去潜在自身反应性的T细胞同时抑制自身免疫反应。鼠DC基于它们的解剖学定位，移植实验和细胞表面表型可以细分为至少两种独特的亚型，髓样DS和淋巴DC。具有CD11c+，MHCII+，CD4+，CD8α-细胞表面表型的DC被称为CD8α-髓样DC，它能够由骨髓前体细胞获得，而具有CD11c+，MHCII+，CD4-，CD8α+细胞表面表型的DC被称为CD8α+淋巴DC，它们存在于胸腺或脾脏中。已经报道鼠CD8α+淋巴DC对类似IL-12的NK细胞(天然杀伤细胞)和T细胞反应也产生IFN-γ(Toshiaki等.，Brief Definitive Report，189(12)，1981-1986(1999))，而且，当将淋巴DC如鼠朗氏细胞注射入CD8α-小鼠中时，它们被转移至淋巴结并分化成为CD8α+DC，并且分化了的CD8α+DC能产生IFN-γ(Miriam等.，Blood，96(5)，1865-1872(2000))。此淋巴DC不仅诱导免疫耐受，而且行使强有力免疫原性的APC的职责抵抗各种同种异型抗原，通过合成IL-12和IFN-γ激活辅助性T细胞I型反应。DC实际上存在于身体的所有组织中，但浓度很低，因此对于来自体内的操作，要获得足够数量的DC是困难的和麻烦的。因此，使用例如几种细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-4(IL-4)，肿瘤坏死因子(TNF-α)和干细胞因子(SCF)，已经进行各种努力从HSC或单核细胞大规模地产生来自体内的DC。通过使用GM-CSF产生了表达CD1a+，CD4+，CD11c+，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，I+类HLA，II+类HLA，CD3-，CD8-和CD14-的DC(Williams等.，Int.Rev.Cytol.，153412(1994)；Santiago-Schwarz等.，Nature，360258(1993)；和Rosenzwajg等.，Blood，87535(1996))。然而，尚没有过报道CD8α+免疫表型的DC(CD8α+DC)在人体内存在，或者CD8α+DC能够从人造血干细胞(HSC)分化而来。专利技术概述因此，本专利技术的首要目的是提供一种CD8α+免疫表型的淋巴树突细胞，其是从人造血干细胞分化而来。本专利技术的另一个目的是提供一种从人造血干细胞分化淋巴树突细胞的方法。本专利技术还有一个目的是提供用于免疫治疗的包含淋巴树突细胞的药物组合物。本专利技术另一个目的是提供一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法。按照本专利技术的一个方面，提供了CD8α+免疫表型的淋巴树突细胞，其是从人造血干细胞分化而来。按照本专利技术的另一方面，提供了一种分化淋巴树突细胞的方法，该方法包括分两步培养人造血干细胞，第一步在含有GM-CSF的第一种培养基中，接着在含有IFN-γ的第二种培养基中。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种用于免疫治疗的药物组合物，其包括治疗有效量的树突细胞。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法，它包括以对治疗该疾病有效的量将淋巴树突细胞对需要其的受试者给药。附图简述本专利技术的上述和其它目的和特征从结合下述附图的本专利技术的下述描述中将变得明显，其中附图说明图1A，1B和1C从人造血干细胞分化的淋巴树突细胞的光学显微镜(A)，扫描电子显微镜(B)和透射电子显微镜(C)照片；图2树突细胞数依赖于培养时间的变化图3A和3B说明淋巴树突细胞免疫表型的柱状图(A培养7天后的细胞；B培养14天后的细胞；x轴细胞数；y轴荧光强度；空心的柱状图(open histogram)阴性对照，填充的柱状图对于细胞表面抗原阳性的细胞组)；图4A和4B说明淋巴树突细胞免疫表型的柱状图(A仅染色CD3和CD4，B仅染色CD3和CD8α)；图5A，5B和5C吞噬FITC-标记的葡聚糖的能力(A对照；B培养1周后的细胞组；C培养2周后的细胞组；空心的柱状图阴性对照，填充的柱状图吞噬FITC-标记的葡聚糖的细胞组)；图6刺激T细胞增殖的能力(◆培养1周后的细胞组，■培养2周后的细胞组)；图7A和7BELISA(酶联免疫吸附测定)结果说明CD的IL-12(A)和IFN-γ(B)的合成能力(1用GM-CSF培养1周后产生的蛋白量；2用GM-CSF培养1周后，接着用IFN-γ培养一周后产生的蛋白量；3用GM-CSF培养1周并用IFN-δ培养一周，接着与添加的离子霉素培养1天后产生的蛋白量)专利技术详述本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞具有CD1a-，CD3-，CD4-，CD8+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+的免疫表型。CD8α+淋巴树突细胞可以通过两步培养造血干细胞来制备，第一步在含有GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的第一种培养基中培养合适的一段时间例如3-9天，接着在含有IFN-γ(干扰素-γ)的第二种培养基中培养，例如3-9天。在本专利技术的方法中，可将GM-CSF和IFN-γ每2-4天，优选3天，加入到培养基中，加入量分别为1-1,000ng/ml和1-1,000U/ml，优选分别为20-200ng/ml和50-500U/ml。为了增强成熟DC的分化，优选在第二阶段培养的较后部分向第二种培养基中加入离子霉素，脂多糖(LPS)或血蓝蛋白(KLH)，加入量为0.1-10μg/ml，优选1μg/ml，并培养直至第二培养时期结束，优选1天。本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞具有优势在于可以高产率生产白介素-12和IFN-γ；可刺激T细胞增殖；并且可以通过活化辅助性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞诱导强有力的细胞免疫反应。本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞可以作为免疫治疗免疫相关疾病的药物组合物的活性成分使用。可以通过使用本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞治疗的免疫相关疾病的非限制实施例，包括任何种类的恶性疾病，结核感染，HIV感染和自身免疫疾病。预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物可以通过将本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞与药用赋形剂或载体混合来制备，或按照任何常规程序通过将其用药用稀释剂稀释来制备。合适的载体，赋形剂和稀释剂的实例是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，水和矿物油。制剂可另外包括填料，抗凝集剂，防腐剂等。可通过使用本领域熟知的任何程序来配制本专利技术的药物组合物，以便在将它们对哺乳动物给药后，提供活性成分的迅速，持续或延迟的释放。因此，制剂可以是无菌的可注射溶液，混悬液，乳剂，溶液等形式，其中无菌可注射溶液是优选的。因此，本专利技术还提供一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法，其包括以对治疗疾病有效的量对需要其的受试者给药本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞。可用常规免疫治疗方法对患者给药本专利技术的CD8α+淋巴树突细胞。具体地，从患者身上取得自身细胞并培养以获得具有免疫增强作用的DC，并且用靶抗原脉冲(pulse)DC。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＣＤ８α↑［＋］免疫表型的淋巴树突细胞，它是由人造血干细胞分化而来。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金炫寿，李京福，金孝哲，
申请(专利权)人：金炫寿，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]