一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备和用途制造技术

一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶Ａ↓［２］同源物及其编码基因，其特征在于，来源于长白山白眉蝮蛇，包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，活性片段和活性衍生物是指具有全部或部分ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２氨基酸序列的多肽。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，涉及一种新的来自于长白山白眉蝮蛇蛇毒的磷脂酶A2同源物及编码这种磷脂酶A2同源物的多核苷酸序列，还涉及所述多核苷酸及其编码的蛋白质用途。
技术介绍
磷脂酶A2(phospholipaseA2，EC3.1.1.4)，简称PLA2，能催化甘油磷脂的第二位脂酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。它广泛存在于生物体内，尤其富含于哺乳动物胰脏的分泌液及蛇和昆虫的毒液中。蛇毒PLA2由一类结构相似(通常含有7对二硫键)，分子量在14kD左右的蛋白质家族组成。除了酶活性外，还具有多种生理活性，如神经毒、心脏毒、肌肉毒、细胞毒、溶血作用、抗凝集作用等。这些活性或者与酶活性相关，或者完全独立于酶活性之外。不同来源的蛇毒PLA2所具有上述生理活性不尽相同，每种PLA2通常只有一种或少数几种生理作用。吴祥甫等从江浙蝮蛇的毒液中分离到3种PLA2(Wu XF等，Acta Biochem Biophys Sin，1984，16(6)664-671)，根据等电点的不同，分别命名为酸性PLA2(APLA2，pI4.5)，中性PLA2(NPLA2，pI6.9)及碱性PLA2(BPLA2，pI9.3)。它们的一级结构同源性较高，空间结构也比较保守，而药理活性有相当大的差异。其中，APLA2能抑制血小板聚集，NPLA2属于突触前神经毒素，BPLA2则具有溶血活性。为了搞清楚PLA2结构和功能的关系，人们对各种来源的蛇毒PLA2进行了大量的研究，包括通过生化提取的方法对蛇毒进行分离纯化，然后对所得PLA2进行氨基酸测序，通过进一步的功能研究来探索不同结构的PLA2结构与功能关系的规律。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种来自长白山白眉蝮蛇(日本蝮蛇乌苏里亚种，Agkistrodon blomhoffii ussurensis，俗名Manushi)的蛇毒磷脂酶A2同源物(Gln-49-PLA2)及其编码基因的制备和用途。本专利技术采用的技术方案是(1)分离纯化出一种新的蛇毒磷脂酶A2同源物，并测定其部分氨基酸序列；(2)克隆编码所述磷脂酶A2同源物的基因并测定其碱基序列；(3)将本专利技术提供的基因导入宿主细胞，使用本基因。(4)提供所述磷脂酶A2同源物性质及用途。一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因，是来源于长白山白眉蝮蛇(日本蝮蛇乌苏里亚种，Agkistrodon blomhoffii ussurensis，俗名Manushi)，包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，活性片段和活性衍生物是指具有全部或部分SEQID No.2氨基酸序列的多肽。制备一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的方法是，分离纯化出一种新的蛇毒磷脂酶A2同源物，克隆其编码基因，插入重组表达载体，并导入宿主细胞，以使用该基因。一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法是(a)适合表达蛇毒磷脂酶A2的条件下，培养权利要求3所述的宿主细胞；(b)从细胞培养物中分离出具有长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物活性的多肽；(c)从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离磷脂酶A2同源物。一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法，编码基因是指一种分离的多核苷酸，其特征在于包含(a)或(b)中至少90％相同性的核苷酸序列(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸；(b)与(a)中的多核苷酸互补的多核苷酸。一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法，重组载体是能在宿主细胞中稳定复制并包含多核苷酸的任何质粒和载体。一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法，宿主细胞是一种遗传工程化的宿主细胞，可选自下组的一种(a)载体转化或转导的宿主细胞；(b)多核苷酸转化或转导的宿主细胞。制备的一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的用途是，利用多肽细胞毒性、肌肉毒性、神经毒性和抗凝血活性等特性，制备用于治疗血栓、肿瘤、神经等疾病以及止痛药物组合物。本专利技术提供的蛇毒磷脂酶A2同源物可通过离子交换层析、凝胶层析和高效液相层析(HPLC)的联合应用得到，SDA-PAGE显示其为单一组份，质谱确定其精确分子量为13881.83±0.33D，等电聚焦电泳测定其等电点为8.56。本专利技术提供的磷脂酶A2同源物具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。序列表明，该磷脂酶A2同源物是一种新的Gln49磷脂酶A2。Gln49磷脂酶A2是指磷脂酶A2氨基酸序列中的第49位氨基酸残基是Gln，按照国际惯例，本专利技术中涉及的蛋白质序列编号是以牛胰PLA2的序列编号作为参照。本专利技术提供的磷脂酶A2同源物可通过常用的蛋白质分离纯化方法适当组合分离纯化得到，如离子交换层析、凝胶层析和高效液相层析(HPLC)等，但本专利技术可采用的方法不限于此。本专利技术不局限于蛋白质的来源，生产方法等，只要它具有说明书中的特征即可。本专利技术提供的蛋白质可以是天然蛋白质，利用基因工程技术由重组DNA表达的蛋白质，或化学合成的蛋白质。本专利技术提供的蛋白质不仅包括具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质，还包括该蛋白质的片段、衍生物和类似物。本专利技术所用术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本专利技术所述多肽相同的生物学功能或活性多肽。本专利技术提供的蛋白质SEQ ID No.2的片段、衍生物或类似物可以是(1)这样一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是或不是由遗传密码子编码的；或者(2)这样一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基；或者(3)这样一种多肽，其中成熟多肽与另一种化合物融合；或者(4)这样一种多肽，其中附加氨基酸融合进成熟多肽，其用来纯化成熟多肽；或者(5)这样一种多肽，一个或多个氨基酸残基被缺失，或者插入或添加一个或多个氨基酸。本专利技术提供了分离的多核苷酸，其基本上是编码SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸。本专利技术提供的多核苷酸序列包括在SEQ ID No.1核苷酸序列中。本专利技术的多核苷酸是从长白山白眉蝮蛇毒腺中分离得到的。它包含366个核苷酸，编码122个氨基酸。本专利技术所用术语“分离”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化。本专利技术提供的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID No.1所示的编码区序列相同或是简并性变异体。本专利技术所用术语“简并性变异体”是指编码具有SEQ ID No.2蛋白质或多肽的核酸序列，但由于密码子的简并性，编码与SEQ ID No.1所示的编码区序列可能不同。编码SEQ ID No.2成熟多肽的多核苷酸包括仅有天然多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列以及非编码序列。术语“编码多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：包永明，安利佳，金礼吉，卜鹏成，杨君，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：