一种重组鸭白介素２制备方法，其特征在于它的步骤如下： １）自中国的绍兴麻鸭和外来品种美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素－２的ｃＤＮＡ与含有Ｐ↓［ＢＡＤ］启动子的原核表达载体ｐＢＡＤ／ｈｉｓ Ｂ组建成高效表达载体ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ｂ／ｄｋＩＬ－２；或者与含有Ｐ↓［ＡＵＧ１］启动子的真核表达载体ｐＭＥＴαＡ组建成高效表达载体ｐＭＥＴαＡ／ｄｋＩＬ－２； ２）用ＲＭ作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌ＬＭＧ１９４； ３）用ＢＭＤＹ作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌ＰＭＡＤ１１和ＰＭＡＤ１６，在表达不同时间加氮源、碳源营养素； ４）大肠杆菌ＬＭＧ１９４诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素２粗制品，ＰＭＡＤ１１和ＰＭＡＤ１６表达的鸭白介素２主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素２粗制品；用Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｒｇａｒｏｓｅ蛋白纯化系统可得到鸭白介素２纯品； ５）制备的重组鸭白介素２纯品或非纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成的成品，保存于－２０℃的冷藏环境中； ６）鸭白介素２单克隆抗体的制备：用重组鸭白介素２纯品抗原免疫小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞及阳性孔的筛选，阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆，液氮保存。获得的单克隆抗体腹水纯化后，液氮保存； ７）鸭白介素２多克隆抗体的制备：用鸭白介素２纯品抗原０．３－０．５ｍｇ，加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子，３周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫，３周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫；７－１０天后采血清，试血测其效价再次加强免疫，７天以后采血清测效价，琼扩效价达１∶３２－６４，离心取上清低温保存。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途。
技术介绍
1997年Sundick等用构建cDNA文库的方法首次从鸡脾脏中获得鸡IL-2基因，1998年Choi等把含信号序列长430个核苷酸的鸡IL-2基因克隆入PUC18载体和真核表达载体pcDNA3，分别在大肠杆菌和CHO-K1细胞中进行表达，得到的两种蛋白都具有鸡T淋巴细胞增殖的生物学活性。1999年Stepaniak等对鸡IL-2体外表达进行了比较深入的研究，将去除前导肽的鸡IL-2基因在大肠杆菌Pgex-2t系统中进行了表达，得到的蛋白具有鸡IL-2蛋白的生物学活性，但表达效率较低仅为63μg/L，且多为非可溶性蛋白，不利于蛋白的回收和纯化。为解决此问题，他们采用了pET32a+高效表达系统，将IL-2与硫氧还原蛋白在缺失硫代还原酶的大肠杆菌菌株中进行融合表达，结果发现蛋白表达量提高到4mg/L，而且绝大部分为可溶性蛋白，该学者同时将含前导肽的完整鸡IL-2基因克隆入真核表达载体pCR3.1+中，在肾成纤维细胞系中进行表达，结果发现该系统不但能稳定表达鸡IL-2蛋白，而且上清和经纯化的蛋白都具有完整的生物学活性，这说明鸡IL-2和哺乳动物IL-2相似，其活性并不依赖于前导序列。成熟的鸡IL-2蛋白是由121个氨基酸组成。它和人IL-2具有相类似的生物学活性，如促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性等功能，在机体免疫中发挥重要作用。家禽中一些造成重大经济损失的疾病如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒、新城疫病毒、传染性贫血病病毒、禽骨髓成红细胞增多症病毒、禽流感病病毒以及球虫感染后大多伴有IL-2分泌异常，因此鸡IL-2可能在抗感染免疫中发挥重要作用。并且，研究发现，鸡IL-2在抗沙门氏菌和寄生虫的实验中效果明显。我们利用RT-PCR技术从鸭脾淋巴细胞中扩增了2个不同品系鸭IL-2的cDNA片段，并实现了在原核和真核细胞中的高效表达，表达产物具有明显的生物学活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组鸭白介素2蛋白制备方法及其用途。重组鸭白介素2蛋白的制备方法的步骤如下 1)自中国的绍兴麻鸭和外来品种美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/his B组建成高效表达载体pBAD/His B/dkIL-2；或者与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成高效表达载体pMETαA/dkIL-2；2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源营养素；4)大肠杆菌LMG194诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素2粗制品，PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素2主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素2粗制品；用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到鸭白介素2纯品；5)制备的重组鸭白介素2纯品或非纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成的成品，保存于-20℃的冷藏环境中；6)鸭白介素2单克隆抗体的制备用重组鸭白介素2纯品抗原免疫小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞及阳性孔的筛选，阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆，液氮保存。获得的单克隆抗体腹水纯化后，液氮保存；7)鸭白介素2多克隆抗体的制备用鸭白介素2纯品抗原0.3-0.5mg，加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子，3周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫，3周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫；7-10天后采血清，试血测其效价再次加强免疫，7天以后采血清测效价，琼扩效价达132-64，离心取上清低温保存。它用于免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。本专利技术的优点(1)大肠杆菌表达的鸭白介素-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在基因工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到鸭白介素-2粗蛋白，且其稳定性好、生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的鸭白介素-2蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到鸭白介素-2粗制品，且目的蛋白具有良好的稳定性和生物学活性；(3)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单，得到的蛋白纯度高；(4)重组鸭白介素-2作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性；作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫系统功能的作用以及促生产作用，dkIL-2蛋白单抗、多抗具有良好的免疫抑制性能；(5)5株鸭白介素-2单抗杂交瘤细胞株稳定性好，抗体分泌能力强，单克隆抗体的效价高和亲合力强。附图说明图1是BSA制定的标准曲线图；图2是重组鸭白介素2原核表达产物的活性检测结果。具体实施例方式重组鸭白介素2蛋白的制备方法的步骤如下1)设计PCR引物，自绍兴麻鸭和美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA片段SEQ No.1、SEQ No.2；2)上述鸭白介素-2cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/dkIL-2；或者上述鸭白介素-2cDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/dkIL-2；3)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；4)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；5)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD11和PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素-2粗制品，PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素-2主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素-2粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到鸭白介素-2纯品；6)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。7)用鸭白介素-2纯品免疫小鼠，获5F6、2B3、1H4、5H6、4G12等5株单克隆抗体杂交瘤细胞株。8)用鸭白介素-2纯品免疫家兔，获得效价达132-64的鸭白介素-2多抗血清。本专利技术中，1鸭白介素-2基因克隆 用刀豆素(ConA)刺激鸡脾细胞，提取总RNA，通过RT-PCR方法分别扩增和克隆了绍兴麻鸭和美洲鸭鸭白介素-2cDNA，将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector，测定鸭白介素-2cDNA序列。2重组表达鸭白介素-2基因工程大肠杆菌的构建绍兴麻鸭鸭白介素-2的PCR扩增产物亚克隆到-新型高效表达载体pBAD/His B中，构建成鸭白介素-2原核表达质粒pBAD/His B/dkIL-2，它能在大肠杆菌LMG194中高效表达，使鸭白介素-2占菌体总蛋白的7～9％，表达率经100次以上传代不降低。3重组表达鸭白介素-2基因工程酵母菌的构建将绍兴麻鸭鸭白介素-2的PCR扩增产物亚克隆到一新型高效真核表达载体pMETαA中，分别构建成鸭白介素-2表达质粒pMETαA/dkIL-2中，用B本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，王金勇，吴建祥，陈吉刚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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