一种高亲和力抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因，其特征在于，包括Ｆ６Ｖ↓［Ｌ］和Ｆ６Ｖ↓［Ｈ］基因序列和氨基酸序列分别为： Ｆ６Ｖ↓［Ｌ］基因序列和氨基酸序列包括ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３核苷酸序列和氨基酸序列如下： １０ｃｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｇｃｔａｔｇｔｃａｇｔａｇｇａｃａｇａａｇ Ｌ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ａ Ｍ Ｓ Ｖ Ｇ Ｑ Ｋ ５５ｇｔｃａｃｔａｔｇａａｃｔｇｃａａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｃｃｔｔｔｔａａａｔａｇｔｔａｃ Ｖ Ｔ Ｍ Ｎ Ｃ Ｋ Ｓ Ｓ Ｑ Ｓ Ｌ Ｌ Ｎ Ｓ Ｙ １００ａｃｔｃａｇａａｇａａｃｔａｔｔｔｇｇｃｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇａｃａｇ Ｔ Ｑ Ｋ Ｎ Ｙ Ｌ Ａ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｑ １４５ｔｃｔｃｃｔａａａｃｔｔｃｔｇｇｔａｔａｃｔｔｔｇｃａｔｃｃａｃｔａｇｇｇａｇｔｃｔｇｇｇ Ｓ Ｐ Ｋ Ｌ Ｌ Ｖ Ｙ Ｆ Ａ Ｓ Ｔ Ｒ Ｅ Ｓ Ｇ １９０ｇｔｃｃｃｔｇａｔｃｇｃｔｔｃａｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔ Ｖ Ｐ Ｄ Ｒ Ｆ Ｍ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｄ Ｆ Ｔ ２３５ｃｔｔａｃｃａｔｃａｇｃａｇｔｇｔｇｃａｇａｃｔｇａａｇａｃｃｔｇｇｃａｇａｔｔａｃｔｔｃ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｖ Ｑ Ｔ Ｅ Ｄ Ｌ Ａ Ｄ Ｙ Ｆ ２８０ｔｇｔｃａｇｃａａｃａｔｔａｔａｇｇａｔｔｃｃａｔｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇａｃｃ Ｃ Ｑ Ｑ Ｈ Ｙ Ｒ Ｉ Ｐ Ｆ Ｔ Ｆ Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ ３２５ａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃｔａａ ３３９ Ｋ Ｌ Ｅ Ｉ ＊ ＣＤＲ１：ａａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｃｃｔｔｔｔａａａｔａｇｔｔａｃａｃｔｃａｇａａｇａａｃｔａｔｔｔｇｇｃｃ Ｋ Ｓ Ｓ Ｑ Ｓ Ｌ Ｌ Ｎ Ｓ Ｙ Ｔ Ｑ Ｋ Ｎ Ｙ Ｌ Ａ ＣＤＲ２：ｔｔｔｇｃａｔｃｃａｃｔａｇｇｇａｇｔｃｔ Ｆ Ａ Ｓ Ｔ Ｒ Ｅ Ｓ ＣＤＲ３：ｃａｇｃａａｃａｔｔａｔａｇｇａｔｔｃｃａｔｔｃａｃｇ Ｑ Ｑ Ｈ Ｙ Ｒ Ｉ Ｐ Ｆ Ｔ Ｆ６Ｖ↓［Ｈ］基因序列和氨基酸序列包括ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３核苷酸序列和氨基酸序列如下： ９ｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｃｇｔｇａａａｃｃｔｔｃｔｃａｇｔｃｔｃｔｇ Ｌ Ｑ Ｅ Ｓ Ｇ Ｐ Ｇ Ｌ Ｖ Ｋ Ｐ Ｓ Ｑ Ｓ Ｌ ５４ｔｃｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｃｔａｃｔｃｃａｔｃａｃｃａｇｔｇｇｔｔａｔ Ｓ Ｌ Ｔ Ｃ Ｓ Ｖ Ｓ Ｇ Ｙ Ｓ Ｉ Ｔ Ｓ Ｇ Ｙ ９９ｔｔｃｔｇｇａａｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａｇｔｔｔｔｃａｇｇａａａｃａａａｔｔｇｇａａｔｇｇ Ｆ Ｗ Ｎ Ｗ Ｉ Ｒ Ｑ Ｆ Ｓ Ｇ Ｎ Ｋ Ｌ Ｅ Ｗ １４４ａｔｇｇｇｃｔａｃａｔａａｇｃｔａｃｇａｃｇｇｔａｇｃａａｔａａｃｔａｃａａｃｃｃａｔｃｔ Ｍ Ｇ Ｙ Ｉ Ｓ Ｙ Ｄ Ｇ Ｓ Ｎ Ｎ Ｙ Ｎ Ｐ Ｓ １８９ｃｔｃａａａａａｔｃｇａａｔｃｔｃｃａｔｃａｃｔｃｇｔｇａｃａｃａｔｃｔａａｇａａｃｃａｇ Ｌ Ｋ Ｎ Ｒ Ｉ Ｓ Ｉ Ｔ Ｒ Ｄ Ｔ Ｓ Ｋ Ｎ Ｑ ２３４ｔｔｔｔｔｃｃｔｇａａｇｔｔｇａａｔｔｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇｃｔａｃａ Ｆ Ｆ Ｌ Ｋ Ｌ Ｎ Ｓ Ｖ Ｔ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｔ ２７９ｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃａａｇａｇａｔｇｇｔｇａｃｔａｃｔａｃｔｔｔｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｒ Ｄ Ｇ Ｄ Ｙ Ｙ Ｆ Ｄ Ｙ Ｗ Ｇ ３２４ｃａａｇｇｇａｃｃａｃｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ ３５０ Ｑ Ｇ Ｔ Ｔ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｓ ＣＤＲ１：ａｇｔｇｇｔｔａｔｔｔｃｔｇｇａａｃ Ｓ Ｇ Ｙ Ｆ Ｗ Ｎ ＣＤＲ２：ｔａｃａｔａａｇｃｔａｃｇａｃｇｇｔａｇｃａａｔａａｃｔａｃａａｃｃｃａｔｃｔｃｔｃａａａａａｔ Ｙ Ｉ Ｓ Ｙ Ｄ Ｇ Ｓ Ｎ Ｎ Ｙ Ｎ Ｐ Ｓ Ｌ Ｋ Ｎ ＣＤＲ３：ｇａｔｇｇｔｇａｃｔａｃｔａｃｔｔｔｇａｃｔａｃ Ｄ Ｇ Ｄ Ｙ Ｙ Ｆ Ｄ Ｙ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，涉及一种单克隆抗体基因，特别涉及一种高亲和力抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因其制备方法。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)是由3个分子量为17kDa的亚单位组成的同源三聚体的可溶型蛋白质，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。体内还存在分子量为26kDa的膜结合形式的TNF。TNF通过诱导血管内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等黏附分子的表达，增加中性粒细胞和淋巴细胞的黏附作用，刺激巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞分泌多种细胞因子和介质，引起炎症反应，导致骨和软骨等组织的损伤。目前认为革兰氏阴性杆菌或脑膜炎球菌引起的弥漫性血管内凝血、中毒性休克主要是由于细菌内毒素刺激单核/巨噬细胞产生大量的TNF，引起发热，心脏、肾上腺严重损害，呼吸循环衰竭，甚至引起死亡。TNF又称恶液素(cachectin)，可诱发机体发生恶液质(cachexia)。恶液质主要表现为进行性体重下降，食欲减退和顽固性机体消耗，其特征是肌肉和脂肪细胞衰竭(这是由于TNF使食欲减退，脂蛋白酶合成抑制所致)等。恶液质导致肿瘤患者死亡率升高。高浓度TNF还可引起心脏血管的变化和代谢紊乱。引起人类艾滋病的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，血清中TNF可升高，而且与脑部病变的严重程度相关。TNF与移植排斥有关，人骨髓移植后，如果TNF水平升高，常有合并症发生；肾移植后发生排斥的患者，血清中TNF水平常见升高。局部缺血再灌注的动物可引起TNF增加；TNF可能是急性肝坏死形成的重要因素。成人呼吸窘迫综合征可能与缺血有关，其病情与支气管肺泡液中TNF水平相关。心肌梗死和急性脑梗塞患者TNF水平升高与病情严重程度有关。TNF与多种自身免疫性疾病有关。类风湿性关节炎局部TNF升高。TNF转基因小鼠可诱发慢性炎症性多发性关节炎，此变化可被有中和活性的TNF单克隆抗体(mAb)所阻断。多发性硬化症发病过程中，TNF可能与脱髓鞘病理变化有关。银屑病局部和血清中TNF水平均见升高。节段性肠炎与TNF水平的升高有关。重症肌无力和系统红斑狼疮(SLE)患者TNF可见升高。由此可见，TNF与感染性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、肿瘤等多种疾病有关。制定多种疾病生物学治疗的策略中，TNF成为关键的靶位。 抗TNF抗体于1987年由Cerami等报导，并获得专利(EPO Patentpublication 0212489，Mar.4，1987)。这些抗体被认为在免疫诊断和治疗细菌感染性休克方面具有重要的作用。同年，Rubin等报导了抗TNF的单克隆抗体，同时报导了分泌该抗体的杂交瘤细胞系、制备该抗体的方法，以及在免疫实验中的应用，该抗体获得了专利(EPO Patent publication 028868，Apr.22，1987)。Yone等于1988年报导了可用于免疫诊断的抗体，并获得EPO专利。该抗体特别用于Kawasaki′s和细菌感染的诊断。Kawasaki′s病人的体液中TNF含量升高，与病情的发展有关。另外，还有许多针对重组TNF的单克隆抗体，其中一些具有中和活性，还有一些通过表位的筛选，构建了测定TNF的ELISA方法和纯化重组TNF的亲和层析技术。 针对TNF的中和性抗血清或单克隆抗体在动物实验中对内毒素和细菌引起的病理改变有明显的阻断作用。TNF通过与细胞表面的TNF受体结合发挥作用，目前认为TNF与受体结合存在4个位点。中和性抗体主要通过对这4个位点的遮盖而阻断TNF的作用。TNF分子有20多种结合B细胞的表位，其中部分表位与受体结合位点重叠，结合这些表位的抗体具有中和活性，发挥对TNF的阻断作用。具有中和活性鼠源性mAb以及来源于它们的片段均具有潜在的治疗价值。然而，这些鼠源性mAb在人体使用时，由于其具有免疫原性，易引起人体的免疫反应，这种免疫反应可引起对抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了解决上述问题，建立了对鼠源性抗体改造的多种方法，如构建嵌合抗体或人源化抗体。在嵌合抗体构建过程中，最为重要的是获得具有良好特异性和中和活性鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链可变区基因，然后将这两条基因与人的抗体恒定区基因连接，构建重组抗体基因。最后，将构建好的人-鼠嵌合抗体基因导入真核细胞中表达。在临床实验中，用抗TNF嵌合抗体治疗类风湿性关节炎和节段性肠炎取得了良好的效果，很好地控制了炎性反应。美国FDA于1998年和1999年分别批准抗TNF嵌合抗体用于临床治疗节段性肠炎和类风湿性关节炎。因此，筛选出高亲和力及中和活性的鼠源单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种高亲和力抗TNF的可变区基因及其制备方法，并获得有高亲和力小鼠抗人TNF单克隆抗体(mAb)的轻链和重链可变区基因的核苷酸序列(包括其高变区的核苷酸序列)以及该基因编码的氨基酸序列。 实现上述专利技术目的的技术方案是(1)制备一组小鼠抗人TNF单克隆抗体，从中筛选出具有高亲和力的抗人TNF单克隆抗体；(2)克隆该单克隆抗体轻链可变区基因；(3)获得该单克隆抗体轻链可变区基因序列和氨基酸序列，确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性。 本专利技术选用高亲和力F6杂交瘤细胞株，从中克隆出轻链可变区基因，测序后，得到其独特的核苷酸序列，为构建具有良好药用价值的抗人TNF嵌合抗体和人源化抗体等打下了良好的基础。高亲和力F6 mAb可制备测定体液中TNF的ELISA试剂盒，在自身免疫性疾病的诊断方面有广泛的应用价值。另外，高亲和力F6 mAb可用于制备纯化重组TNF的亲和层析柱，在制备药用重组人TNF等领域有很大的应用价值。 附图说明 图1是本专利技术的F6VL基因(包括CDR1、CDR2和CDR3)序列及其编码的氨基酸序列；图2是F6VL基因序列和与其同源性最高的基因序列的同源性比较；图3是F6VL氨基酸序列和与其同源性最高的氨基酸序列的同源性比较。 具体实施方式 以下结合附图对本专利技术作进一步的详细说明。 可变区基因的完整核苷酸序列、其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等)以及抗体可变区的氨基酸序列等，是嵌合抗体和人源化抗体构建的基础。为此，申请人用重组人TNF免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人TNF单克隆抗体。利用间接ELISA方法筛选出高亲和力F6 mAb，并利用单抗阻断TNF诱导L929细胞凋亡的实验，单抗阻断TNF诱导ECV304细胞ICAM-1表达的实验，以及单抗阻断TNF诱导NF-κB核转位的实验等，鉴定F6 mAb具有较高的中和活性。该株杂交瘤细胞，具有稳定分泌抗体的能力。 1.技术方案及其路线1.1小鼠抗人TNF高中和活性单克隆抗体的制备1.1.1单克隆抗体的制备、纯化按常规方法，用重组人TNF(购自第四军医大学生物技术中心)免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)，制备一组小鼠抗人TNF单克隆抗体。按常规方法制备腹水。腹水经硫酸铵沉淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的F6 mAb纯度达到94％。 1.1.2 TNF mAb亲和力的测定用间接ELISA方法测定纯化前后单抗的相对本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高亲和力抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因，其特征在于，基因序列和氨基酸序列如下10 ctgacccagtctccatcctccctggctatgtcagtaggacagaagL T Q S P S S L A M S V G Q K55 gtcactatgaactgcaagtccagtcagagccttttaaatagttacV T M N CK S S Q S L L N S Y100 actcagaagaactatttggcctggtaccagcagaaaccaggacagT Q K N Y L AW Y Q Q K P G Q145 tctcctaaacttctggtatactttgcatccactaggg...
【专利技术属性】
技术研发人员：金伯泉，刘雪松，朱参胜，杨琨，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：
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