一种EMS诱变培育烟草突变体的方法技术

本发明专利技术属于烟草育种技术领域，具体涉及一种采用EMS（甲基磺酸乙酯）诱变剂大规模高效培养烟草突变体的方法。该方法包括预处理烟草种子，EMS处理，种子萌发和移栽、筛选变异植株、统计萌发率和存活率等步骤。本发明专利技术特别对烟草主栽品种K326进行EMS处理条件优化，探索使得烟草K326达到半致死，获得最优EMS处理条件。本发明专利技术可用于烟草突变体库的构建、丰富烟草遗传育种资源、可直接用于新品种选育、具有不需要高世代回交的优点。

A method of EMS mutagenesis for cultivation of tobacco mutants

The invention belongs to the field of tobacco breeding technology, and specifically relates to a large-scale and efficient method for cultivating tobacco mutants by using EMS (ethyl methanesulfonate) mutagen. The method includes pretreatment of tobacco seeds, EMS treatment, seed germination and transplanting, screening of mutant plants, statistical germination rate and survival rate. The invention especially optimized the EMS treatment conditions of the main tobacco variety K326, and explored the semi lethal K326 of tobacco and obtained the optimal EMS treatment conditions. The invention can be used for constructing tobacco mutant library, enriching tobacco genetic breeding resources, directly used for breeding new varieties, and having no need for backcrossing of high generation.

【技术实现步骤摘要】
一种EMS诱变培育烟草突变体的方法
本专利技术属于烟草育种
，具体涉及一种采用EMS（甲基磺酸乙酯）诱变剂大规模高效培养烟草突变体的方法。
技术介绍
传统品种选育主要有系统育种法和杂交育种法。创制优良品种的过程中，系统育种法对一个优良变异单株经反复筛选比较形成一个系统（群体），最终成为一个新品种的过程较长（主要包括大田选株，株行试验，品系比较试验，区域试验和生产试验，品种审定和推广几个步骤）。而采用杂交育种法由野生烟草资源向栽培烟草中导入优质遗传资源时往往伴随有连锁累赘，将破坏优良种质的最佳遗传构成，很可能会带来不利性状。传统烟草育种为去除这些连锁累赘，通常需花费5-8年时间不断进行回交，而去除连锁累赘的最终效果可能依然不甚理想。总体而言，传统育种选育优良种质的工作周期较长、工作量大。育种工作者在传统育种的基础上创造出诱变育种的新方法，即在优良种质上直接诱导基因突变而产生新的品种。诱变育种的新技术主要包括三种方式：插入诱变、物理/辐射诱变和化学诱变。经典的插入诱变方法依赖于外源DNA元件（如转座子）插入植物基因组，破坏植物自身基因读码框架产生的“基因敲除”品系，然后鉴定“基因敲除”对品系性状的影响。但敲除突变具有两个缺陷：首先，“基因敲除”会导致基因功能被严重扰乱，转座子插入通常会造成目标基因功能完全丧失。而在大多数情况下，育种的目标是仅需要调控基因功能，而不是彻底使目标基因丧失功能，因为基因功能的完全缺失有可能造成植物性状的巨大改变甚至使植物死亡；其次，即使通过转座子插入的方法得到具优良性状的品种，因新品种引入了外源转座子的标签序列，当前的政策和法规极大地限制了采用此方法产生的新品种的推广和应用。物理/辐射诱变是利用射线处理导致植物基因组的部分片段缺失，从而获得新的表型/性状。但射线处理通常造成较大的染色体片段缺失，在获得新的性状的同时可能会丢失一些重要的农艺和经济性状。化学试剂诱变技术较转座子插入诱变（只能导入1-4个外源DNA元件插入）和物理/辐射诱变（常伴随着染色体大片段缺失）具有较大优势。其中，EMS（EthylMethanesulfonate，甲基磺酸乙酯）诱变不需要进行外源DNA元件的遗传转化，只造成基因组上某些核苷酸的点突变，对植物基因组影响小，类似于天然自发突变。另外，EMS诱变处理平均在植物每1M染色体区段能够诱导得到3~4个遗传变异位点，且对植物整个基因组的诱变覆盖均匀、更为全面；故效率更高，能够提供更加广泛、更多潜在的等位基因变异。目前EMS化学诱变育种技术已在水稻、玉米、小麦等主要农作物上得到广泛应用。烟草是重要的经济作物，但是烟草在新品种选育的过程中，却面临着遗传关系狭窄的问题，怎么创制新的烟草新品种是育种专家面临的一个问题。鉴于EMS诱变育种技术具有常规育种及转基因育种所没有的优势，因此该技术是可优先用于烟草育种工作中。烟草K326是烟草的主栽品种，具有易考、品质高的优点，目前尚无非常详细的烟草主栽品种K326诱变技术优化体系。为此，本专利技术研发一种EMS诱变培养烟草（特别是K326）突变体的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种EMS诱变培育烟草突变体的方法，步骤如下所示：（1）预处理烟草种子：选择饱满的烟草种子，取40000粒烟草K326种子，用水洗净，接着在0.1mol/L磷酸钾溶液（pH=7.0）中浸泡8h，吸水纸吸干；（2）EMS溶液处理：将经预处理的烟草种子在体积分数为0%、0.30%、0.50%、0.70%、0.70%、1.10%、1.50%的EMS溶液中浸摇，分别浸摇8h、12h、16h，将诱变后的烟草种子用磷酸盐缓冲溶液冲洗50遍，再用流水冲洗0.5h，自然风干；收集EMS废液并进行解毒处理；（3）种子萌发和移栽：将经EMS溶液处理后的种子点到MS平板上，再将萌发的烟草植株种子移栽至漂浮育苗盘中，每个孔移栽1株苗，观察烟苗生长情况；（4）筛选变异植株：在经EMS处理得到的存活烟苗中，根据植株最终存活率，进一步筛选出变异植株；（5）统计种子萌发率和幼苗存活率，得到最佳EMS体积分数×处理时间组合。附图说明图1为编号A8的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图2为编号A12的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图3为编号A16的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图4为编号C8的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图5为编号C12的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图6为编号C16的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图7为编号D8的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图8为编号D12的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图9为编号D16的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图10为编号E8的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图11为编号E12的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图12为编号F8的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况；图13为编号CK的EMS体积分数×处理时间烟草幼苗存活情况。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的一种EMS诱变培育烟草突变体的方法，包括如下步骤：（1）预处理烟草种子：选择饱满的烟草种子，取40000粒左右种子，用水洗净，接着在0.1mol/L磷酸钾溶液（pH=7.0）中浸泡4~6h，吸水纸吸干；作为本专利技术的一种优选，选择的烟草种子的萌发率应高于98%。（2）EMS溶液处理：将经预处理的烟草种子在体积分数为0%、0.30%、0.50%、0.70%、0.70%、1.10%、1.50%的EMS溶液中浸摇，分别浸摇8h、12h、16h，将诱变后的烟草种子用磷酸盐缓冲溶液冲洗50遍，再用流水冲洗0.5h，自然晾干；收集EMS废液并进行解毒处理。EMS废液的解毒处理方法为将前5次冲洗得到的EMS废液倒入1mol/LNaOH溶液中进行消解。（3）种子萌发和移栽：将经EMS溶液处理后的种子点到MS平板上，再将萌发的烟草植株种子移栽至漂浮育苗盘中，每个孔移栽1株苗，观察烟苗生长情况；作为本专利技术的一种优选，将经EMS溶液处理后的种子点到MS平板的密度为100粒/平板。（4）筛选变异植株：在经EMS处理得到的存活烟苗中，根据植株最终存活率，进一步筛选出变异植株。作为本专利技术的一种优选，植株的存活率为50%左右。（5）统计种子萌发率和幼苗存活率，得到最佳EMS体积分数×处理时间组合。作为本专利技术的一种优选，所述的最佳EMS体积分数×处理时间组合为0.70%×12h或1.10%×8h。。本专利技术所述的EMS诱变培育烟草突变体的方法对烟草主栽品种K326效果最佳。烟草K326是烟草的主栽品种，具有易考、品质高的优点。本专利技术为K326提供了诱变技术优化体系。本专利技术还可用于烟草突变体库的构建、丰富烟草遗传育种资源、可直接用于新品种选育、具有不需要高世代回交的优点。实施例1：烟草品种K326种子预处理在室温25℃条件下，取61.5mL1mol/L的K2HPO4和38.5mL1mol/L的KH2PO4混匀配制出100mL溶液，再稀释10倍至1000mL即可配制成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EMS诱变培育烟草突变体的方法，其特征在于，步骤如下所示：（1）预处理烟草种子：选择饱满的烟草种子，称取40000粒烟草K326种子，用水洗净，接着在0.1 mol/L磷酸钾溶液（pH=7.0）中浸泡4~6h，吸水纸吸干；（2）EMS溶液处理：将经预处理的烟草种子在体积分数为0%、0.30%、0.50%、0.70%、0.70%、1.10%、1.50%的EMS溶液中浸摇，分别浸摇8h、12h、16h，将诱变后的烟草种子用磷酸盐缓冲溶液冲洗50遍，再用流水冲洗0.5h，自然晾干；收集EMS废液并进行解毒处理；（3）种子萌发和移栽：将经EMS溶液处理后的种子点到MS平板上，再将萌发的烟草植株种子移栽至漂浮育苗盘中，每个孔移栽1株苗，观察烟苗生长情况；（4）筛选变异植株：在经EMS处理得到的存活烟苗中，根据植株最终存活率，进一步筛选出变异植株；（5）统计种子萌发率和幼苗存活率，得到最佳EMS体积分数 ×处理时间组合。

【技术特征摘要】
1.一种EMS诱变培育烟草突变体的方法，其特征在于，步骤如下所示：（1）预处理烟草种子：选择饱满的烟草种子，称取40000粒烟草K326种子，用水洗净，接着在0.1mol/L磷酸钾溶液（pH=7.0）中浸泡4~6h，吸水纸吸干；（2）EMS溶液处理：将经预处理的烟草种子在体积分数为0%、0.30%、0.50%、0.70%、0.70%、1.10%、1.50%的EMS溶液中浸摇，分别浸摇8h、12h、16h，将诱变后的烟草种子用磷酸盐缓冲溶液冲洗50遍，再用流水冲洗0.5h，自然晾干；收集EMS废液并进行解毒处理；（3）种子萌发和移栽：将经EMS溶液处理后的种子点到MS平板上，再将萌发的烟草植株种子移栽至漂浮育苗盘中，每个孔移栽1株苗，观察烟苗生长情况；（4）筛选变异植株：在经EMS处理得到的存活烟苗中，根据植株最终存活率，进一步筛选出变异植株；（5）统计种子萌发率和幼苗存活率，得到最佳EMS体积分数...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨大海，姚恒，谢贺，白戈，陈学军，逄涛，李勇，黄昌军，刘勇，方敦煌，肖炳光，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53