α－淀粉酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及亲本类透阿米尔α－淀粉酶的变体，它相对所述亲本α淀粉酶，至少以下性能之一发生改变：ｉ）在ｐＨ８到１０．５的ｐＨ稳定性提高；和／或ｉｉ）在ｐＨ到１０．５对Ｃａ↑［２＋］的稳定性提高，和／或ｉｉｉ）在１０℃到６０℃的温度范围，特异活性增强。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及亲本类透阿米尔(Termamyl-like)α-淀粉酶的变体(突变体)，其在中温和/或高pH下的活性更高。
技术介绍
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)构成这样一组酶，它们催化淀粉和其他线性及分枝1，4-葡萄糖苷寡-糖和多糖的水解。有大量专利和科学文献涉及这类工业上非常重要的酶。从例如WO90/11352，WO95/10603，WO95/26397，WO96/23873和WO96/23874可以知道许多α-淀粉酶，比如类透阿米尔α-淀粉酶变体。在更近期的涉及α-淀粉酶的公开文献中，WO96/23874提供了一种类透阿米尔α-淀粉酶的三维，X-射线晶体结构数据，该酶含有解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BANTM)的300个氨基端氨基酸残基以及含有所述氨基酸序列的地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶的羧基端301-483位氨基酸(后者以透阿米尔TM的商品名出售)，因此该酶与工业上很重要的芽孢杆菌α-淀粉酶(其在本文中包含在术语“类透阿米尔α-淀粉酶”中，该术语特别包括地衣形芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌(BANTM)和嗜热脂肪芽孢杆菌(BSGTM)α-淀粉酶)有密切的关系。WO96/23874还描述了在分析亲本类透阿米尔α-淀粉酶之结构的基础上，设计相对亲本改变了性质的亲本类透阿米尔α-淀粉酶之变体的方法。专利技术简述本专利技术涉及新的类透阿米尔α-淀粉酶的α-淀粉分解酶变体(突变体)，该变体在高pH和中温的洗涤能力(相对亲本α-淀粉酶)提高。在本专利技术文中术语“中温”意指10℃到60℃，优选20℃到50℃，特别是30℃到40℃。术语“高pH”意指目前用于洗涤的碱性pH，更具体说是大约pH8到10.5。在本专利技术文中，“低温α-淀粉酶”意指一种在0-30℃的温度范围内具有相对最佳活性的α-淀粉酶。在本专利技术文中，“中温α-淀粉酶”意指一种在30℃-60℃的温度范围内具有最佳活性的α-淀粉酶。比如，SP690和SP722α-淀粉酶分别是“中温α-淀粉酶”。在本专利技术文中，“高温α-淀粉酶”意指一种在60℃-110℃的温度范围内具有最佳活性的α-淀粉酶。比如，透阿米尔是一种“高温α-淀粉酶”。本专利技术的变体可以实现这些特性的改变类透阿米尔α-淀粉酶在pH8到10.5的稳定性；和/或在pH8到10.5对Ca2+的稳定性；和/或在10℃-60℃，优选20℃-50℃，特别是30℃-40℃的特异活性。应当注意的是，相对最适温度通常取决于所用的特定pH。换句话说，在例如pH8确定的相对最适温度可能与例如pH10确定的相对最适温度非常不同。温度对酶活性的影响活性部位及其周围的动力学取决于温度和氨基酸组成，并且对一种酶的相对最适温度有重要意义。通过比较中温和高温α-淀粉酶的动力学，可以确定出高温α-淀粉酶在中等温度下的功能关键区域。图2显示了SP722α-淀粉酶(SEQ ID NO2)和地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶(以Termanyl购自Novo Nodisk)(SEQ ID NO4)。图中显示，在中温范围(30-60℃)，SP722绝对活性的相对最适温度比同源的地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶高，后者在60-100℃左右具有最佳活性。这些分布图主要取决于活性部位残基及其周围的温度稳定性和动力学。另外，活性分布图取决于所用pH和活性部位残基的pKa。本专利技术更具体地涉及1.一种亲本类透阿米尔α-淀粉酶的变体，该变体具有α-淀粉酶活性，所述变体包含1或多个突变，其对应于下列SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的突变T141，K142，F143，D144，F145，P146，G147，R148，G149，Q174，R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，S193，N195，H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F173，F267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，K311，E346，K385，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463。2.项1的变体，所述变体有1或多个下列取代或缺失 T141A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；K142A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；F143A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F145A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；G147A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；R148A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G149A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；S193A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亲本类透阿米尔α－淀粉酶的变体，该变体具有α－淀粉酶活性，所述变体包含１或多个突变，其对应于下列ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示氨基酸序列中的突变：Ｔ１４１，Ｋ１４２，Ｆ１４３，Ｄ１４４，Ｆ１４５，Ｐ１４６，Ｇ１４７，Ｒ１４８，Ｇ１４９，Ｑ１７４，Ｒ１８１，Ｇ１８２，Ｄ１８３，Ｇ１８４，Ｋ１８５，Ａ１８６，Ｗ１８９，Ｓ１９３，Ｎ１９５，Ｈ１０７，Ｋ１０８，Ｇ１０９，Ｄ１６６，Ｗ１６７，Ｄ１６８，Ｑ１６９，Ｓ１７０，Ｒ１７１，Ｑ１７２，Ｆ１７３，Ｆ２６７，Ｗ２６８，Ｋ２６９，Ｎ２７０，Ｄ２７１，Ｌ２７２，Ｇ２７３，Ａ２７４，Ｌ２７５，Ｋ３１１，Ｅ３４６，Ｋ３８５，Ｇ４５６，Ｎ４５７，Ｋ４５８，Ｐ４５９，Ｇ４６０，Ｔ４６１，Ｖ４６２，Ｔ４６３。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：托宾V博彻特，阿伦斯文森，卡斯滕安德森，比贾尼R尼尔森，托宾L尼森，索伦克贾鲁尔夫，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]