维管组织优选的启动子制造技术

本发明专利技术提供了在植物中调节异源核苷酸序列表达的组合物和方法。组合物包括编码维管组织优选的野黑樱苷水解酶基因的新启动子核苷酸序列及由其分离的序列。提供了采用这里公开的启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。该方法包括在植物细胞基因组中稳定地掺入与本发明专利技术维管组织优选的启动子可操作地连接的核苷酸序列，并产生表达该核苷酸序列的稳定转化的植物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及植物中基因表达的调节。
技术介绍
异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于具有在植物宿主中起作用的可操作地连接的启动子。启动子序列的选择将决定异源DNA序列在生物体中表达的时间和位置。因此，当需要在植物优选的组织中表达时，使用组织优选的启动子。相反，当需要在全部植物细胞中基因表达时，组成型启动子是选择的调节单位。在核心启动子序列上游和/或下游的附加调节序列可包括在转化载体的表达结构中，以引起异源核苷酸序列在转基因植物中不同水平的组织优选的或组成型表达。常常希望DNA序列在生物体组织中有优先的表达。例如，通过植物基因组的遗传操纵，使之含有与异源除草剂基因可操作地连接的组织特异启动子，使得抗昆虫物质在易感植物组织中特异地表达，可能实现植物对昆虫侵袭的抗性增加。异源核苷酸序列在适当组织中的优先表达减少了组成型启动子在全部植物细胞中启动异源核苷酸序列转录所发生的植物资源消耗。可选择地，可能需要抑制天然DNA序列在植物组织中的表达以获得所需的表现型。在此情况下，通过转化植物以包含可操作地连接反义核苷酸序列的组织特异启动子，可能实现这种抑制，使得反义序列的组织特异表达产生在植物细胞亚群中干扰天然DNA序列mRNA翻译的RNA转录体。韧皮组织在各种植物器官中传送营养物、激素和其它物质。韧皮的实质细胞参与蔗糖和其它营养成分加载或卸载于韧皮传送系统中。韧皮组织中汁液的高营养成分使韧皮成为各种昆虫的靶标，其中包括蚜虫(Aphididae科)、玉米螟(家螟蛾)和叶蝉(Cicadellidae)。这些昆虫侵扰经多个机制对植物产生损害，包括丧失营养物和水给昆虫、侵扰后将病毒颗粒引入韧皮组织中并使组织对真菌侵袭易感。需要有维管组织优选的与帮助植物抗病原体如昆虫、病毒、真菌、线虫及类似物的异源核苷酸序列可操作地连接的启动子。另外需要维管组织优选的启动子序列，它能可操作地连接修饰维管组织加载特性的异源核苷酸序列，从而影响植物发育和成熟、碳分配和谷物收获量。通过改变涉及韧皮加载的物质水平，可以影响维管组织的加载特性、植物发育和植物生长。需要能够用来调整控制维管组织加载的物质表达的启动子序列。维管组织优选的启动子在改善茎强度上可能还有用途。例如，通过细胞壁加厚，如沉积更多的纤维素。为增加细胞壁强度，使用维管组织优选的启动子来表达与纤维素生物合成有关的基因是理想的。预期，当玉米茎中细胞壁强度增加时，可获得较好的站立性能。这与改善玉米抗茎倒伏特别相关。这种用途的实例是，使用维管组织特异的启动子驱动与次生胞壁形成有关的基因如阿布属thaliana的irx3基因(Taylor NG，Scheible WR，Cutler S，Somerville CR，Turner SR.1999.阿布属的不规则xylem3位点编码次生胞壁合成所需的纤维素合成酶。Plant Cell 11769-80)。在此情况下，通常不具有次生胞壁的细胞可能会获得额外的细胞壁生长，从而得到较强的细胞结构。因此，需要分离和鉴定韧皮优选的启动子以遗传操控植物具有特定的表现型特征，该启动子能够作为目的异源核苷酸序列组织优选表达的调节区。专利技术概述提供了在植物中调节异源核苷酸序列表达的组合物和方法。组合物包括新的启动子序列，它们以维管组织优选的方式启动转录，特别是韧皮组织优选的方式。具体地说，提供了从编码野黑樱苷水解酶的野黑樱桃基因分离的转录起始区。此外，本专利技术的组合物包括SEQ IDNO.1中列出的核苷酸序列及其片段。本专利技术的组合物进一步包括与SEQ ID NO.1中列出的序列具有至少70％同一性的核苷酸序列或其片段，以及在严格条件下与上述任何一个序列杂交的核苷酸序列。SEQ IDNO.2中列出的序列代表了为克隆目的制备的核苷酸序列的修饰。包括野黑樱苷水解酶启动子区的野黑樱苷水解酶操纵子序列列在SEQ IDNO.3中。SEQ ID NO.3的989-2626核苷酸编码野黑樱苷水解酶多肽。SEQ ID NO.4是野黑樱苷水解酶多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO.5和6是SEQ ID NO.1公开的多核苷酸序列的相关变化。本专利技术的组合物还包括含有启动子序列的DNA结构，所述启动子序列与目的核苷酸序列可操作地连接，其中启动子能够在植物细胞中驱动核苷酸序列的表达。还提供了含本专利技术新启动子序列的转化植物细胞、转化植物和转化种子。提供了在植物中表达目的核苷酸序列的方法。该方法包括在植物细胞基因组中稳定地掺入表达盒，所述表达盒含有与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列，其中启动子能够在植物细胞中启动核苷酸序列转录。本方法进一步提供了在维管组织中，更具体地在韧皮组织中优选地表达核苷酸序列的方式。附图简要说明附图说明图1描绘野黑樱桃野黑樱苷水解酶的启动子区核苷酸序列。图2是SEQ ID NO.1(PH DL1.4 PRO)和SEQ ID NO.5(PH DL1.1PRO)两个基因组片段的对比和共有序列，突出显示相关的启动子序列模式和基序793-796位置的TATA盒，659-662位置的CAAT信号，259-267位置的RGATAOS基序(R-GATA，GATA基序结合因子，稻米Tungro细菌样病毒(Rice Tungro Bacilliform Virus)的韧皮特异性基因表达所需)结合位点。图3是显示转基因玉米植物的各种组织中GUS表达的表。图4是携带PHP17688的玉米T0植物中的GUS表达。A.10541640中脉60天；B.10541657节间85天，纵向切片(箭头指向沿维管束的GUS表达)；C.10541665节间85天，横切片；D.10541628花粉囊60天；E.10541665谷粒4 DAP；F.10541647谷粒8 DAP。图5说明阿布属植物中planta土壤杆菌介导的转化后GUS的表达。专利技术详述本专利技术的组合物是含新核苷酸序列的核酸分子，新序列是编码野黑樱苷水解酶的野黑樱桃基因的植物启动子。此启动子序列使得可操作地连接的核苷酸序列的维管组织优选的表达，更具体地是韧皮优选的表达。具体地说，本专利技术提供分离的核酸分子，其含有专利保藏号PTA-3235的细菌宿主中贮存的编码DNA序列的核苷酸序列，或SEQID NO.1中列出的核苷酸序列，及其变异体和片段。此启动子序列分离自5’-非翻译区，与编码野黑樱苷水解酶的野黑樱桃基因转录起始位点侧面相连。本专利技术含野黑樱桃启动子序列的质粒于2001年3月27日保藏在American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，Virginia的专利保藏库中，并指定为专利保藏号PTA-3235。SEQ ID NO.1的最后两个核苷酸，核苷酸987和988，在ATCC保藏的质粒序列中从C’s改变为T’s。此保藏物将在为专利程序保藏微生物的国际公认布达佩斯条约的条款下保留。此保藏物仅为方便本领域技术人员而制备，而非根据35 U.S.C.§112必需的保藏物准入条件。本专利技术包括分离的或实质上纯化的核酸组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物学活性部分，实质上或基本上没有与其天然存在环境中所见核酸分子相伴随或相互作用的成分。因此分离的和纯化的核酸分子或其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有选自以下的核苷酸序列的分离的核酸分子：　　　　ａ）包括ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．：２所列序列的核苷酸序列；　　　　ｂ）包括ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．：２所列序列的至少５０个连续核苷酸的核苷酸序列；　　　　ｃ）包括与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．：２所列序列具有至少７０％同一性的序列或其片段的核苷酸序列，其中所述的序列调节转录；和　　　　ｄ）在严格条件下与ａ）、ｂ）、ｃ）或其互补序列杂交的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SE阿比特，李春平，牛小牧，
申请(专利权)人：先锋高级育种国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]