由脐血CD34*细胞体外诱导生成巨核细胞的方法技术

从脐血ＣＤ３４↑［＋］细胞体外诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，包括先在含有胎牛血清及人干细胞因子（ＳＣＦ）、人血小板生成素（ＴＰＯ）和／或ｆｌｔ－３配体的培养基中体外扩增脐血ＣＤ３４↑［＋］细胞；然后再采用含有人血小板生成素（ＴＰＯ）、人白细胞介素－３（ＩＬ－３）和／或人粒－巨系集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的无血清培养基诱导巨核细胞的生成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种体外诱导生成巨核细胞的方法，具体地说涉及由脐血CD34+细胞在体外诱导生成巨核细胞的方法。
技术介绍
巨核造血是由多潜能造血干细胞启动，通过形成成熟的巨核细胞，最终形成血小板的复杂的生物学过程。巨核细胞的生成，一般分为三个发育阶段祖细胞、未成熟巨核细胞(巨核前母细胞)和成熟巨核细胞。一些有丝分裂信号，如细胞因子、胞外基质可促使巨核祖细胞增殖。巨核前母细胞是一种瞬态细胞，好比是架在祖细胞、成熟细胞和分裂后细胞之间的桥梁。巨核造血是一个独特的造血过程，从造血祖细胞池发育巨核细胞既需要细胞的有丝分裂又需要核内的有丝分裂-核复制。成熟的巨核细胞停止增殖，细胞不再分裂，但在其成熟的过程中核内的有丝分裂依旧进行，DNA含量继续增加，形成各种倍体的巨核细胞，最后释放出血小板。巨核细胞和血小板作为人体血细胞的重要组分，在临床上有重要应用价值。首先在临床上对血小板的输注需求很大，对各种原因引起的血小板缺乏症而言，输注血小板是常用的治疗方案。此外目前放疗化疗依然是癌症治疗的主要手段，但是很多患者在接受放、化疗后常常容易发生血小板缺乏症，这是癌症治疗中的主要风险之一；另外一些恶性疾病常需要通过造血干/祖细胞移植来恢复患者的造血功能，而造血干/祖细胞移植是否成功取决于中性粒细胞和血小板的恢复时间，有研究证明造血干/祖细胞移植后能快速重建中性粒细胞造血，但要使血小板恢复到相应的水平还需要很长的时间，因此，目前临床上对这类病人一般仍需要输入相当数量的血小板，可见血小板对于肿瘤放化疗后的支持性治疗也具有重要意义。但目前血小板输入有产生同种抗体并有并发血小板输入抗性的风险，几年前克隆出来的血小板生成素TPO虽然能够调控体内的巨核造血过程，如de SauvageFJ，Hass PE，Spencer SD等人1994年在Nature所报道(Stimulation ofmegakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-MPL ligand.Nature 1994；369533.)，但是到目前为止，临床试验表明TPO的应用不能令人满意地缩短放化疗后引起的血小板缺乏期。临床研究发现，在常规的干细胞移植后，再输注体外扩增的同源自体的巨核细胞可加速病人血小板的恢复。但是骨髓、动员的外周血和脐血中，巨核细胞的数量很少，而按照巨核细胞临床输注的要求，输入的巨核细胞数要达到1×105-2×106cells/kg，一个病人按照50kg计，需要输注的总细胞数要达到5×106-1×108，所以必须通过体外扩增技术，提供大量的巨核细胞，才能满足临床应用的要求。而且给病人输入巨核祖细胞之后，输入的细胞在体内能进一步增殖，从而增加体内血小板数量，缓解血小板的缺乏。目前已有将体外扩增的巨核细胞用于临床实验，如意大利的骨髓移植中心，从动员的外周血出发，通过体外诱导巨核细胞的生成，使巨核细胞扩增50余倍后，将其应用到接受了自体外周血祖细胞移植的乳腺癌病人体内，则病人不再需要输入同种异型的血小板，而对照组的病人都需要血小板输入支持。而且接受体外培养的细胞的病人并没有出现不良反应和细菌感染的现象，临床初步实验表明，体外扩增的巨核祖细胞可安全地应用到临床方面。近十年来临床上对血小板输入的需求大约增加了3倍，采用替代的细胞类产品可有效补充目前血小板供应的不足，因而体外诱导巨核细胞的扩增研究有重要的实际应用价值。一些实验室已经研究开发了体外培养系统，从骨髓，动员外周血和脐血中生产巨核祖细胞输血产品。目前人们还主要致力于寻找细胞因子的最佳组合，合适的培养基和合适的培养系统(塑料容器，特氟隆表面容器或自动细胞灌流生物反应器)。1996年，据Schattner M，Lefebvre P，MingolelliSS，et al.，Thrombopoietin-stimulated ex vivo expansion of human bone marrowmegakaryocytes.Stem Cells.1996，14(2)207-214.文献报导，Schattner等人采用含有TPO、SCF、IL-3及1％HAS、2.5％HS的IMDM培养BM CD34+或MNC，获得了较大数量的巨核细胞；1997年，根据Bertolini F，BattagliaM，Pedrazzoli P，et al.Megakaryocytic progenitors can be generated ex vivo andsafely administered to autologous peripheral progenitor cell transplantrecipients.Blood，1997，892679～2685的文献报导，Bertolini等人采用无血清培养系统，在MGDF、SCF、IL-3、IL-6、IL-11、MIP-1a、FL多种细胞因子的作用下，培养来自于动员的外周血中的CD34+细胞，体外扩增第7天所获得的MK细胞已用于临床输血，移植到病人体内加速了血小板恢复。但是，上述文献采用的起始细胞是外周血或骨髓中CD34+细胞，体外诱导巨核细胞产生的起始细胞可以是来源于骨髓、动员外周血和脐血中的造血干/祖细胞。与成人外周血和骨髓相比，脐血来源丰富，富含CD34+细胞，具有高增生及长期骨髓造血重建的能力；而且脐血造血干/祖细胞的免疫原性尚未发育成熟，可以减少GVHD的发生几率和降低异源病毒感染的危险性。临床资料证实，HLA完全或部分匹配的脐血移植均可以重建遗传性和恶性疾病患者的骨髓造血功能。相比骨髓和动员外周血，脐血中所含的CD34+细胞，是适宜于体外诱导巨核细胞生成的起始细胞(Helen Tao，Leonie Gaudry，Alison Rice，et al.Cord blood is better than bonemarrow for generating megakaryocytic progenitor cells.ExperimentalHematology，1999，27293-301.)这些方法都是直接从新鲜分离出的脐血CD34+细胞出发来诱导巨核细胞的生成，由于脐带血中CD34+细胞的含量有限，绝对数量少，作为诱导巨核细胞的起始细胞，其数量的多少直接影响巨核细胞的诱导效率，导致诱导出的巨核细胞的数量有限，无法满足临床的要求，因此迫切需要找到一种方法提高巨核细胞的体外扩增细胞效果。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是公开一种从脐带血CD34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床医疗的需要。本专利技术的技术构思是这样的单份脐血中CD34+绝对量少，不利于体外大量诱导巨核细胞的生成，为此专利技术人设计了一种分段式培养策略，先在体外扩增CD34+细胞，再使其诱导分化成巨核细胞。采用该方法可提高由CD34+细胞出发诱导生成巨核细胞的效率。本专利技术的方法包括先在含有胎牛血清及人干细胞因子(SCF)、人血小板生成素(TPO)和/或flt-3配体的培养基中体外扩增脐血CD34+细胞；然后再采用含有人血小板生成素(TPO)、人白细胞介素-3(IL-3)和/或人粒-巨系集落刺激因子(GM-CS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭文松，蔡海波，顾小华，
申请(专利权)人：上海伯瑞生物技术发展有限公司，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：