非特异性富集细菌细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用阳离子或阴离子聚合物和磁性载体非特异性富集细菌细胞的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种利用阳离子或阴离子聚合物和磁性载体非特异性富集(enrichment)细菌细胞的方法。几乎每一种细胞成分的处理、分析或分离的起始点都是细胞的富集，即“细胞收获(cell harvest)”。后者通常是以离心来实施。因为除了将离心机整合到相应的自动设备所用的高技术之外，在离心程序的起始与停止位置都需要极端高的精确度，所以此离心步骤成为在方法完全自动化(例如质粒纯化)中的主要问题。所以，在细胞化合物的处理、分析或分离中之自动化方法通常是用已经在自动设备以外富集、离心或沉积过的细胞起始的。但是，实现相关方法的尽可能的完全自动化对于例如完整基因组、蛋白质组(proteomes)的快速分析，以及对于高通量方法中结构和功能的迅速解析等都是必要的。不过，部份步骤的自动化程度，例如在基因组分析方面，已经非常先进。例如，细菌培养和质粒分离都可以自动地实施。然而，现在仍缺乏一种行之有效的包括细胞收获在内的简单、低成本且完全自动化的方法。标准的细胞收获方法为细菌培养物的离心。对此而言，需要用到微滴定板离心机(micro-titre-plate centrifuge)，特别是要设计用于较高通量的方法之中者。另一种方法系利用过滤膜将培养的细胞富集(例如WO 01/51206，3M Innovative Properties Co(US)与US 5,464,541，Diagen Institut f.Molekularbiologie)。不过，此种方法在使用高度富集的细胞悬液且因此溶液具有高粘度的情况中，显然会非常易于出现堵塞等意外事件。类似地，对于采用离子交换装置(例如结合到一多孔型基质并过滤)和真空技术的情况也是如此(WO 92/07863，Qiagen)。此种情形会产生许多问题，尤其是对于自动化方法。利用以磁性颗粒为基底的方法进行微生物的富集在原则上适合于自动化。到目前为止已经有三种细菌富集所用方法被述及，不过其在菌株特异性方面以及生产成本方面都明显地显示存在缺点。EP1 118676 A2，Chemagen AG和WO 01/53525 A2，Genpoint AS述及一种以固相富集微生物的方法，其使用一经共价键或非共价键方式固定化在此固相的非特异性配体。就此方法而言，所用固相为聚乙烯醇珠，其可为磁性或非磁性。于此方法的要旨中，将可以作为微生物所用的养分的分子视为配体。此方法的缺点在于某些配体必须固定化到一支持物上，此可能导致生产费用之显著增加。另一项缺点在于对于不同的菌株可能需要固定化不同的配体，此意味着该磁珠和该方法将缺乏通用性。于另一专利申请中，亦即WO 98/51693，Genpoint述及使用含有盐类、醇类和聚乙二醇或可与聚乙二醇相比的聚合物的混合物在磁性颗粒上面富集细菌。于WO 98/51693中所述的方法需要花5-20分钟及添加2-50％(w/v)的聚合物。此种高浓度的盐类和聚合物会在细菌的后续处理中产生问题，这是因为，例如30％的聚乙二醇非常粘稠，或高浓度的盐会干扰SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。WO 00/29562，Merck Patent GmbH述及一种从微生物分离出质粒DNA的方法，包括a)将微生物培养物酸化，并与固体表面材料(solidface material)(二氧化硅-磁性颗粒)温育与混合，及b)随后将质粒纯化。不过，此种方法并非对于所有大肠杆菌(E.coli)菌株而言都是可行的，因为其可能导致一定程度的产率上的损失。此种方法的另一项缺点在于所需的珠之量，因为珠的费用会构成细菌富集费用的主要中心，而特别是二氧化硅珠相当昂贵。由于二氧化硅珠可能主要结合到DNA，因此用该二氧化硅珠来分离质粒的过程中，也会观察到产率的减损。WO 91/12079，Amersham述及一种在可非特异性地结合到聚合物(细胞)的磁珠上沉淀细胞的方法。于此方法中，必须强制地遵守所需药剂(醇和盐类)与磁珠的添加顺序。在使用之前将药剂及/或药剂与珠混合是不可能的，如此一来就不能省却吸移步骤，而省却吸移步骤对于自动设备的最优利用的自动化是必要的。另外，其可使用的磁性颗粒仅局限于纤维素/氧化亚铁颗粒。US 6,284,470 B1，Promega述及完整细胞与磁性颗粒形成复合体。就可应用的磁珠而言，此方法仅局限于二氧化硅颗粒。由于此种方法指定需要将一体积的醇加到一体积的细胞悬液，因此该方法显然不能在产率没有任何明显减损之下应用深孔板(deep-well-plates)进行细胞收获。再者，高浓度的醇可能导致蛋白质沉淀。有许多研究显示阳离子聚合物可能与细菌交互作用。例如，实验显示出阳离子聚合物例如脱乙酰壳多糖(chitosan)(脱乙酰壳多糖为一种经去乙酰基的壳多糖(chitin))非常适合用于单细胞实验中对活的微生物细胞进行包囊化(encapsulation)或“封装(sealing)”(参阅例如MethodsEnzymol.1987，vol.135，259-268，或US 5,489,401)。脱乙酰壳多糖也可用来对珠聚合物之内活性生物材料进行包囊化处理(US 4,647,536和WO 01/46266)。脱乙酰壳多糖也可用来——视情况也以其改质形式——包被免疫检测所用的对象或实验试剂盒(US 5,208,166)。不过，有关阳离子聚合物对于微生物细胞壁所具疏水性的影响的文章业已证明，在pH值高于3时，疏水性表面的粘着力会显著地增加，但在pH值低于3时会减低到几乎为0％(参考资料Goldberg，S.，Doyle，R.J.和Rosenberg，M.，1990，J.Bacteriol.vol.172，5650-5654)。使用以磁性颗粒支持的方法可具有进一步的优点，因为如此一来便有可能分别进行单个孔(例如在深孔板中)的收获，而不需要收获整个板。如此一来，例如在表达研究(expression Study)的范围之内，可以依时间相关方式进行收获。总之，可以确定的是，在目前还没有一种不需离心步骤即可完成且可同时用于多种不同细菌的简单方法可以用来有效率、快速、低成本地富集细菌细胞。所以，本专利技术的任务为提供一种不需离心步骤即可完成非特异性地富集细菌细胞的方法。此问题由后附权利要求书所界定的主题予以解决。 附图说明本专利技术要用下列图式予以更详细地示范说明。图1显示出使用不同的磁性颗粒进行大肠杆菌(E.coli)LE392(浅色条)和TG2(黑色条)细胞收获所得产率之结果。数值指示的是以上清液的浊度与所用细胞悬液的光密度的比值测定得到的产率％。缩写代表Silica(二氧化硅)MagPrep Silica Beads(Fa.MERCK，Darmstadt，Germany)；NH2氨基聚苯乙烯珠(Fa.Estapor，MERCK-Eurolab)；COOH羧基聚苯乙烯珠(Fa.Estapor，MERCK-Eurolab)；PS聚苯乙烯珠(Spherotech，Illinois，USA)；PVA聚乙烯醇珠(Chemagen，Baesweiler，Germany)。图2显示出使用二氧化硅珠(黑色条)和脱乙酰壳多糖/氨基聚苯乙烯珠(浅色条)在酸性pH值下进行细胞收获所得产率之结果。于图2中将根据本专利技术的方法所得细胞收获产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非特异性纯化细菌的方法，其包括下列步骤：ａ）将含有细菌细胞的样品与一种阳离子聚合物在酸性ｐＨ值下接触，ｂ）添加一种磁性载体，ｃ）从所述的样品中分离出其上面结合了细菌细胞的该磁性载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙宾迪乐，雷瑞特格拉贝尔，史特方米勒，英格丽罗伯，迈可修斯，汤玛斯詹德，
申请(专利权)人：普罗佛斯公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]