水稻稻米糊化温度主效控制基因ALK及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种控制水稻稻米糊化温度的主效基因，该基因的核苷酸序列选自：（１）编码ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２所示的氨基酸序列的核苷酸序列；（２）与（１）中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻稻米糊化温度的功能的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种控制水稻稻米糊化温度的蛋白质、含有本发明专利技术的基因的植物表达载体、和一种培育植物的方法，该方法可使植物淀粉的主要储藏器官的糊化温度发生变化，包括用含有本发明专利技术的基因的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株的步骤。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种控制水稻稻米糊化温度的主效基因，以及该基因编码的蛋白质。本专利技术还涉及一种含有本专利技术的控制水稻稻米糊化温度的转基因植物表达载体和利用该表达载体培育植物的方法，该方法可使植物淀粉的主要储藏器官的糊化温度发生变化。
技术介绍
糊化温度是农作物，尤其是水稻稻米的重要蒸煮品质。而糊化温度又与淀粉粒中支链淀粉结构直接有关。支链淀粉支链的非还原端指向颗粒表面呈放射状排列，形成晶体层和无定形层交替排列的9nm的周期性半晶体结构。晶体层由同一分支簇内相邻的A链或B链间形成双螺旋结构紧密排列而成；无定形层主要包括松散分支点。分支簇内精细结构的变化会导致物种间、品种间和组织间淀粉理化特性的变化。而植物支链淀粉的生物合成是一个非常复杂的代谢过程，涉及到可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶和淀粉脱支酶等。因此，糊化温度可能与淀粉代谢途径中的某些关键酶相关。对水稻不同糊化温度品种(包括突变体)的研究便是揭示与该性状相关的支链淀粉生物合成机理和相关基因的有效途径。首先，从表型上描述水稻稻米糊化温度，早在20世纪60年代就用碱解反应来间接测定。生物化学研究发现糊化特性与淀粉粒相对结晶度有关(γ＝+0.73)，而淀粉粒结晶度又与支链淀粉结构紧密相关，因此该性状与支链淀粉的合成有关。分子标记遗传定位研究表明控制糊化温度至少有三个等位基因，其中2号染色体1个，6号染色体2个。日本科学家最近发现支链淀粉链长性状的遗传分离模式与淀粉粒的理化特性完全一致，控制该性状的基因命名为ACL，而ALK和ACL二基因定位在染色体同一位点。但至今未见克隆相关基因的报道。由于糊化温度是支链淀粉结构特性的反映，因此参与支链淀粉生物合成的酶，如可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶和淀粉脱支酶的表达或活性的改变都将引起糊化温度不同程度的变化。近年来对豌豆和衣藻突变体的研究发现支链淀粉晶体构建中SSSII是必需的。它负责合成支链淀粉分支簇的主要成分——中等长度的葡聚糖，在支链淀粉分支簇内短链(A+B1链)延伸、B2和B3链合成中起明显作用，从而影响淀粉粒的形态和淀粉的晶体模式。水稻的糊化温度作为评价和改善蒸煮和食味品质的重要指标，近年来多有报道，但仅限于表型、生化及遗传定位等方面。本专利技术便是利用糊化温度差异大的品种配制的群体和图位克隆技术首先克隆了ALK基因，该基因编码一种可溶性淀粉合酶SSSII，分子生物学和生物化学研究表明该基因控制水稻胚乳支链淀粉的结构。同时我们已通过基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术的一个目的是提供一种控制水稻糊化温度的主效基因。本专利技术的另一个目的是提供一种由本专利技术的控制水稻稻米糊化温度的基因所编码的蛋白质。本专利技术的再一个目的是提供一种含有本专利技术的控制水稻稻米糊化温度的转基因植物表达载体。本专利技术的又一个目的是提供一种培育植物的方法，该方法可使植物淀粉的主要储藏器官的糊化温度发生变化。本专利技术提供了一种控制水稻稻米糊化温度的主效基因，该基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻稻米糊化温度的功能的核苷酸序列。严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。本专利技术的控制水稻稻米糊化温度的主效基因优选具有如图6和SEQ IDNO1所示的DNA序列。本专利技术还提供了一种由上述核苷酸序列编码的蛋白质。该蛋白质优选具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本专利技术中的SEQ ID NO2和图7所示的蛋白质属于可溶性淀粉合酶II家族。ALK与玉米SSIIa同源性为69.8％，该酶可能编码一种可溶性淀粉合酶，直接参与支链淀粉生物合成。1、本专利技术还提供了一种含有本专利技术的控制水稻稻米糊化温度的主效基因的植物表达载体。这种表达载体可以是如图4所示的(pCAMBIA1300-ALK和pCAMBIA-Ubi’Anti-Alk)，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽。2、本专利技术还提供了一种培育植物的方法，该方法可使植物淀粉的主要储藏器官的糊化温度发生变化，包括用本专利技术的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株的步骤。附图说明下面结合附图对理解本专利技术作进一步的详细描述，但并非对本专利技术作限定。图1表示图位克隆所用亲本和F2群体中糊化温度的表型鉴定。两亲本双科早和C堡及F2代植株所结种子的碱消试验。随机取20粒成熟种子去壳后置于6cm培养皿(20粒/皿)，加入2％(W/V)KOH(5ml/皿)，加盖置于30℃恒温培养36小时。双科早和C堡分别作为正、负对照。图2示ALK在水稻第6染色体上的初步定位图。图3表示ALK基因的精细定位及物理定位。图4示转化所用载体图谱。图5表示功能互补实验T0代转基因水稻所结种子的表型。T0-3，T0-5为转正义ALK基因T0代植株所结种子；Anti-T0-1，Anti-T0-3为转反义ALK基因T0代植株所结种子。图6示ALK基因的DNA序列(籼稻双科早)。图7示ALK基因编码的氨基酸序列(籼稻双科早)。具体实施例方式实施例11、水稻材料水稻(Oryza sativa ssp.)高糊化温度籼稻品种“双科早”和低糊化温度粳稻品种“C堡”。2、分析和定位群体纯合的籼稻品种“双科早”和粳稻品种“C堡”进行杂交，F1代自交后共得到7068个F2个体，并从中选出1,352个个体作为定位群体。在苗期每株取2克左右的嫩叶，用来提取DNA。3、通过SSR，STS，和CAPS标记定位ALK基因采用改进的CTAB方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一个SSR、STS或CAPS反应用1μl DNA样品。在ALK基因的初步定位阶段，对由10个F2个体组成的混合池进行SSR分析，发现ALK基因与第6号染色体RM50和RM527标记连锁，并定位于二标记间。在此基础上，我们设计了PCR引物分别以两个亲本的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将ALK初步定位在SSR标记M4741和M4785之间。为了将ALK定位在一个PAC克隆上，我们用已公布的水稻品种Nipponbare的PAC文库(http//rgp.dna.affrc.go.jp)序列构建了ALK位点附近的contig，设计PCR引物分别以两个亲本的基因组DNA为模板进行PCR扩增。两个亲本的PCR产物分别用100多种不同的限制酶消化，经2％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测酶切产物的多态性。以此发展了CAPS标记，并用于群体精细定位，最终将其定位在一个BAC克隆AP003509上。4、AL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制水稻稻米糊化温度的主效基因，该基因的核苷酸序列选自：（１）编码ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列的核苷酸序列；（２）与（１）中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻稻米糊化温度的功能的核苷酸 序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李家洋，钱前，高振宇，周奕华，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]