培养组织的保存方法技术

本发明专利技术提供培养组织的保存方法，该方法可长时间保存培养组织，并且在使用培养组织时可不用进行洗净操作。解决方法为：将培养软骨细胞得到的培养软骨组织用不含冷冻保护剂、来自矿物的微粒状物以及ｐＨ判定试剂等非容许成分的等张盐类溶液如磷酸缓冲液、林格系保存液或生理盐水在２～２５℃经过１０天的输送期间进行保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤其涉及通过培养细胞而获得的。
技术介绍
近年，可通过体外(生物体外)培养细胞而获得培养组织。这样的培养组织可用作填补患者受损部的移植用组织，也可用作研究药物、化妆品功效的试验用组织。以前，这些培养组织作为移植用或作为试验用的使用是在预定的机构内制备的，但近年，通过外部委托等利用在机构外制备的培养组织的机会增加。在机构外制备的培养组织，必须解决在到达使用机构的距离和时间内是维持其品质的状态。因此研究了在输送时用于至少将培养组织维持在良好状态的手段。例如，专利文献1公开了在添加了冷冻保护剂的保存液中浸渍培养组织的冷冻保存技术。专利文献2公开了将培养的上皮细胞片浸渍在DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)中在8-19℃低温保存的技术。另外，专利文献3描述了在由添加了抗菌性沸石的生理盐水构成的器官保存液中冷藏保存器官。特表平09-505032号公报特许2693640号公报特开平02-129101号公报
技术实现思路
但是，含有二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂的保存液、含有抗菌性沸石等微粒状物的保存液、以及以含有酚红等pH判定试剂的DMEM等培养基为基础的保存液，由于是对人体的直接影响不明确的成分，从确保高安全性出发，使用时需要进行洗净操作。特别是将培养组织作为移植用组织使用时，为了确保更高的安全性，必须充分洗净。因此，上述这些保存液的组成，在使用时要进行繁琐的洗净步骤，成为手术者或操作者的负担。另一方面，在器官移植等中，虽然已知输送器官时所使用的器官保存液，但由于从生物体取出或采得的“器官”与通过体外(in vitro)培养细胞获得的“培养组织”在细胞和细胞外基质(ECM)等的组成方面并不完全相同，其特性也必定不相同，因此将各种器官保存液直接用于保存培养组织不能说都可行。另外，由于器官保存液中也包含多种成分，在移植时要进行洗净。鉴于上述现有技术，本专利技术的目的是提供，该方法可在输送期间等规定期间保存培养组织，并且在使用培养组织时无须洗净操作。本专利技术的为对通过培养细胞而获得的，其特征在于，将上述培养组织在培养后，于不含有非容许成分的等张盐类溶液(BSS平衡盐溶液)中且在规定温度保存。本专利技术的上述等张盐类溶液优选为缓冲液或输液剂。更优选上述缓冲液为磷酸缓冲液，上述输液剂为生理盐类溶液，进一步优选林格系保存液或生理盐水。根据本专利技术的保存方法，经过输送期间后的培养组织可以良好状态保存，且使用前不用洗净操作即可使用。附图说明 该图显示在本专利技术实施例中使用PBS进行保存，经过规定保存期间后的活细胞密度相对于保存开始时的活细胞密度的比例。该图(a)显示在本专利技术实施例中使用PBS、各种器官保存液及林格液进行保存，在2～8℃保存10天后活细胞密度的变化；图(b)显示在13℃保存10天后活细胞密度的变化。该图(a)显示在本专利技术实施例中使用PBS、器官保存液及林格液进行保存，在4℃保存时活细胞密度的变化；图(b)显示同样在13℃保存时活细胞密度的变化。该图显示在本专利技术实施例中使用PBS、生理盐水及林格液进行保存，经过保存期间时的活细胞密度变化。该图显示在本专利技术实施例中使用林格液进行保存，在各保存期间活细胞密度随时间的变化。该图显示在本专利技术实施例中使用多种保存液在6℃保存2天的活细胞率。该图显示在本专利技术实施例中使用多种保存液在13℃、2天保存期间后的活细胞率。具体实施例方式本专利技术的为对通过培养细胞而获得的培养组织在培养后，于不含有非容许成分的等张盐类溶液中且在规定温度保存的方法。这些溶液通常作为补充体液的输液剂，或者为分散细胞、洗净细胞、组织、脏器等分别选择使用的溶液，本专利技术人发现这些溶液在用于至今未被使用的所谓保存培养组织的用途中是有效的，从而完成了本专利技术。本专利技术中所述“保存”不同于在与体内相近的环境下使细胞增殖的“培养”，所述“保存”是指维持活细胞以使经过了输送期间以及直至使用之前的一段期间的培养组织，在经过该输送和/或保存期间后维持可再进行“培养”或移植的状态，从而保存培养组织经过规定时间。另外，本专利技术中所述“保存”相对于可长期保存的冷冻保存而言，是指相当于较短期间的输送期间(例如，几小时至几天左右)等的保存，不包括需要冷冻保护剂的冷冻状态的输送或保存、或使用处理液反应和洗净那样的几分钟～几十分钟的极短时间的保存状态。本专利技术的等张盐类溶液是指与体液大致等张的且主成分为无机盐类的溶液。所述“与体液大致等张的”是指相对于体液具有1.5～0.8的渗透压比。渗透压比优选为相对于体液为0.9～1.1，可根据作为保存对象的培养组织的种类进行适当选择。另外，体液分为细胞外液和细胞内液，这两种体液的组成特点在于，主要的阳离子成分不同，细胞外液为高钠(Na)低钾(K)，细胞内液为低钠(Na)高钾(K)。对此，本专利技术的等张盐类溶液优选其阳离子成分为钠离子较钾离子含量高的细胞外液(高Na、低K)组成。另外，本专利技术的等张盐类溶液不含有非容许成分。所述非容许成分为动物来源的血清、蛋白质等非人源动物成分，或者即使为人来源成分但可诱导排斥反应的成分，特别是不能否定可引起过敏性休克的动物胶等成分，或者为植物、矿物来源的但当体内大量使用时可引起细胞或组织功能的大幅度降低的成分，以及其量大大超出人体应用限度的药物等，例如包含胎牛血清(FBS)、冷冻保护剂、矿物来源的微粒状物、pH判定试剂等。但是，由于作为医药品其被体内摄取的成分被确认具有安全性，因此也可含有。这些非容许成分，特别是FBS等，虽然有时作为培养组织的培养基使用，但与来自自身的成分不同，鉴于在体内长期或高浓度存在时有危险，通常为在应用于体内前进行洗净去除的成分。作为含有非容许成分的溶液，可列举例如，添加了血清成分的液体培养基、添加了血清成分的器官保存液、含有提取蛋白质(如白蛋白、球蛋白等)的培养基等，它们不相当于本专利技术的等张盐类溶液。但是，来源于移植对象自身的成分没有必要以安全性为理由进行排除，因此，可包含在本专利技术的等张盐类溶液中。作为等张盐类溶液，可列举例如，缓冲液和输液剂等。输液剂是指为了补充体液、补正电解质平衡、补充营养等而非经口施与的电解质输液和营养输液，一般使用电解质输液等来代替体液或补充体液。另外，输液剂优选为以无机盐类为主体的生理盐类溶液，可添加葡萄糖等。作为本专利技术可使用的生理盐类溶液，可列举生理盐水、林格液、洛克液、199培养基(ア—ル液)、hank’s液、蒂罗德液，这些生理盐类溶液一直以来是可作为进行电解质输液的输液剂利用的。另一方面，本专利技术可使用的缓冲液只要是在分散细胞、洗净细胞、组织、器官、调整培养基的渗透压和pH等中可利用的缓冲液即可，可列举磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等。另外，碳酸缓冲液包含仅由可化学定义的化合物构成的基础培养基。此类基础培养基一直以来由于其不能使细胞增殖，所以不用其单独进行培养和保存，虽然添加了本专利技术的非容许物质血清、蛋白质、生长因子等而作为增殖用培养基使用，但在本专利技术中以不含有这样的非容许物质的状态使用。在本专利技术中，缓冲液优选磷酸缓冲液，输液剂优选生理盐类溶液，尤其优选林格系保存液或生理盐水。本专利技术中林格系保存液优选以选自一般作为电解质输液而使用的林格液、乳酸林格液、醋酸林格液组成的组中的至少一种作为其基础的保存液。本文档来自技高网...

【技术保护点】
培养组织的保存方法，是通过培养细胞而获得的培养组织的保存方法，其特征在于，将所述培养组织在培养后置于不含非容许成分的等张盐类溶液中并且在规定温度下保存。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：山本刚之，菅原桂，加藤雅一，福岛里佳，井家益和，蜷川欣秀，
申请(专利权)人：株式会社日本组织工程，
类型：发明
国别省市：JP[日本]