一种新型导向溶栓剂，其制备方法及用途技术

一种新型导向溶栓剂，为鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶的杂合体，其特征在于具有序列表中序列１所示的氨基酸序列，或序列表中序列１的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，更确切地说涉及一种新型导向溶栓剂，还涉及其制备方法及应用。
技术介绍
随着社会工业化程度的提高，生活节奏加快及饮食习惯的改变，心血管疾病已经成为当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一。其中血栓病引起的死亡率和致残率极高，常见的血栓性疾病主要有急性心肌梗死、脑血栓和静脉血栓等。血栓在血液循环系统中的非正常形成往往是导致此类疾病的直接原因。因此有效地清除堵塞血管的病理性血栓，疏通血管，恢复缺血组织正常的血液流通，实现对组织正常的营养、氧气供应，成为治疗的关键。目前的治疗主要包括两个方面手术治疗及药物治疗。作为常规的治疗手段，选用良好的溶栓药物一直是治疗方案的首选。经过30多年的研究和实践，溶栓制剂经历了多次的更新换代，第一代溶栓制剂包括链激酶、尿激酶等，第二代溶栓制剂包括t-PA，scu-PA和葡激酶等。但这些溶栓制剂在临床应用中都出现了一些明显的问题，主要集中体现在对血栓的特异性差、临床使用剂量大，并导致全身性出血等毒副作用。因而目前，国内外都在积极地开展第三代溶栓药物的研制。第三代溶栓制剂研制的思路是通过基因工程技术，对天然的溶栓药物进行结构改造，以提高溶栓剂的血栓特异性和延长溶栓剂的半衰期，从而减少溶栓剂的临床使用剂量，减少其毒副作用。目前的研究主要集中在两个方面，其一为改造t-PA或构建t-PA/scu-PA嵌合体，以期提高溶栓制剂对血栓特异性溶解能力。第二个方面则主要是利用血栓特异性抗体进行导向溶栓。目前，在导向溶栓制剂的研制中都是采用尿激酶或低分子量单链尿激酶作为溶栓剂，因而研究的焦点在于导向抗体。由于在血栓形成过程中，产生了一些新的抗原标志，包括纤维蛋白，激活的血小板表面GPIIb/IIIa受体以及损伤血管内皮等，因而这些抗原标志提供了导向抗体的结合靶位作用。在国外，早在二十世纪九十年代初就开始了利用抗人纤维蛋白的抗体进行导向溶栓药物的研制，在不同的动物(包括仓鼠和狒狒等)体内进行溶栓实验表明，构建的抗体-尿激酶杂合体能够降低溶栓剂的使用剂量10倍以上，而且能够极大的延长溶栓剂在体内的半衰期。(Characterization of achimeric plasminogen activator consisting of a single-chain Fv fragment derivedfrom a fibrin fragment D-dimer-specific antibody and a truncated single-chainurokinase.J Biol Chem.1991 Oct 15；266(29)19717-24.)在1999年，德国汉堡大学的一个研究小组利用抗人纤维蛋白抗体和抗活化血小板抗体与尿激酶进行偶联，制备了双特异性的导向溶栓制剂，体外实验表明，制备的双特异性的导向溶栓制剂的纤溶活性提高约10倍(Abispecific antifibrin-antiplateleturokinase conjugate(BAAUC)induces enhanced clot lysis and inhibits plateletaggregation.Biochim Biophys Acta 2001 Apr 7；1546(2)399-405)。但是这些研究所用的导向抗体都为鼠抗体，而鼠抗体用于体内时因其较强的免疫原性而导致人抗鼠抗体反应(HAMA)，并降低了重复用药的效果。因而近年来，国外大量的研究单位和制药公司都在积极的研制免疫原性低的人源化(humanized)抗体或人抗体。截至到2002年，文献报导的在美国进行临床试验的约100多种抗体中，其中绝大部分为人源化抗体和人源性抗体(其中有大约60％为人源化抗体)。因而在现阶段，制备和采用免疫原性更低的人源化抗体或人源性抗体作为导向抗体研制导向溶栓药物是大势所趋。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型导向溶栓制剂，该溶栓制剂是一种杂合体，是将抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)融合而成。本专利技术主要包括如下内容鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)杂合体，它具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，或序列表中序列1的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。编码上述杂合体氨基酸序列的DNA序列，其中之一如序列表中序列2所示。上述杂合体的制备方法包括如下步骤1、A11-scuPA32k融合基因的构建和克隆鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)为本专利技术的专利技术人利用噬菌体表面呈现技术筛选到的一株对人纤维蛋白特异的鼠抗体。利用PCR等方法，构建出A11-scuPA32k融合基因，该融合基因的DNA序列之一如序列表中序列2所示。然后利用常规的分子克隆技术将该融合基因克隆至原核表达载体pET15，转化大肠杆菌BL21(DE3)，建立表达A11-scuPA32k融合基因的工程菌株。2、A11-scuPA32k融合基因在大肠杆菌中的可溶性表达利用IPTG诱导，如上所述的工程菌株能够表达重组A11-scuPA32k杂合体，而且胞内可溶组分中能够检测到明显的尿激酶活性，表明重组蛋白至少部分以可溶蛋白形式存在于胞内。3、重组A11-scuPA32k杂合体的纯化利用兔抗尿激酶抗体，采用亲和层析方法对表达的重组A11-scuPA32k杂合体进行纯化，纯化产物达到电泳纯(图1)。重组A11-scuPA32k杂合体具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。4、重组A11-scuPA32k杂合体的体外活性分析利用溶圈法分析纯化后重组A11-scuPA32k杂合体的尿激酶的溶纤功能，利用体外血栓吸附实验分析纯化后重组A11-scuPA32k杂合体结合血栓的能力，结果表明制备的重组A11-scuPA32k杂合体保持了良好的双功能(图2，图3)。5、重组A11-scuPA32k杂合体的体内溶栓实验在大鼠体内制备血栓模型，分析重组A11-scuPA32k杂合体的体内溶栓效果，结果表明得到相同体内溶栓效果时，重组鼠单链抗体-尿激酶融合蛋白的用量约为尿激酶用量的1/4(图4，5，6，7)。人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体(IIn)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)杂合体，它具有序列表中序列5或7所示的氨基酸序列，或序列表中序列5或7的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。编码上述杂合体氨基酸序列的DNA序列，其中编码序列表中序列5所述氨基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列6所示，编码序列表中序列7所述氨基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列8所示。上述杂合体的制备方法包括如下步骤1、IIn-scu-PA-32k融合基因的构建和克隆在分子模建的基础上，利用表面重塑的人源化方案对鼠抗人纤维蛋白单链抗体进行了人源化改造。然后借助于噬菌体表面呈现技术，采用CDR3突变和DNA shuffling等方法对人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体进行了体外亲和力成熟，并筛选到如序列表中序列3所示的一株人源化单链抗体，该人源化单链抗体的亲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：俞炜源，刘志刚，黄君健，林建波，徐桂清，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：