培养和增殖脂肪组织来源的干细胞的方法技术

一种培养和增殖衍生于人脂肪组织的多潜能干细胞的方法，该方法包括：　　　　（１）提供从３－１８岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；　　　　（２）提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；　　　　（３）于未分化条件下，在步骤（１）得到的条件培养基中传代培养步骤（２）得到的干细胞以进一步纯化并之；　　　　（４）分离步骤（３）得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术的领域本专利技术涉及脂肪组织衍生的干细胞，特别是涉及一种在细胞未分化条件下以较高的增殖速率培养成人脂肪组织衍生的干细胞的方法。专利技术的背景机体对细胞和组织的损伤有着巨大的修补和恢复能力，不仅可以恢复细胞和组织的结构，而且还可在不同程度上恢复其功能。。一般说来，这些修复过程都是通过局部未受损组织细胞的分裂和增殖来完成的。目前临床上广泛采用的组织修复方法包括自体组织移植、异体组织移植和使用天然或化学合成的组织替代物。其中自体组织移植虽然避免了免疫排斥反应，但一般都要损伤人体自身的正常组织；而异体移植则可导致免疫排斥，并存在供体来源有限和论理问题。使用人工组织替代物同样也存在异物排斥问题，并且有造成感染的危险。随着再生医学的建立和发展，科学家们已经有可能应用细胞工程和组织工程技术，基于基质网架、相应的组织细胞和生长因子三个基本要素，模拟机体组织器官的天然条件和发育生物学规律，掺入活细胞、天然细胞成分、细胞合成产物及细胞内和细胞间调节物质等，人工构建例如软骨、骨、肌腱、肌肉、皮肤、血液、心瓣膜及血管等不同的生物组织和器官。再生医学包括组织器官形态再生和功能再生两个方面。一般说来，人们总是期望再生的组织不仅能够从形态学上修复或替代受到损伤的局部细胞或组织，同时更希望能够恢复和补偿受损伤细胞或组织的生理功能。近年来，随着分子生物学技术和临床医学的不断进步，基因治疗这一医疗方法已引起了越来越多的医学研究与临床工作者的关注和积极参与。目前，已出现了许多将转移或修饰遗传材料的技术与细胞工程或组织工程技术相结合，用于修复或补偿局部组织或器官的遗传缺陷或功能缺失(或低下)的研究报导(如参见美国专利6,077,981、6,103,230、6,264,941等)。然而，这些技术非常复杂，所需成本很高，目前仍处于早期实验室研究阶段。为了有效地修补和恢复局部受损伤细胞的正常形态与功能，除了目前尚存在大量的技术问题有待解决和选择使用即有良好的组织相容性，又能极好地模拟体内环境的细胞外基质(ECM)外，顺利地取得并培养移植后持续保留其固有形态与功能的种子细胞，仍是细胞工程和组织工程领域内一个亟待解决的问题。近年来，由于不受人类伦理观念的影响而且没有免疫学排斥问题，所以使用骨髓干细胞再造各种中胚层起源的组织的研究已取得了很大进展。人骨髓是由胚胎的中胚层演化来的，主要由造血干细胞和基质细胞组成(Paul，SR.，Blood771723，1991)。虽然目前人们对造血干细胞的分裂和分化已有了较多的了解，但有关基质细胞群的研究还有待深入。人和哺乳动物的骨髓基质细胞是包括多种细胞成份的异质细胞群体，其中之一即是能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和成骨细胞等多种细胞成分的多潜能基质干细胞(Caplan，AI.etal.，J.Orthop.Res.9641，1991)。并且提示这些细胞有可能用于软骨、脂肪和骨等组织的修复(参见美国专利5,827,735、5,906,934、5,908,784和6,322,784)以及细胞或组织的遗传修饰(参见美国专利5,591,625)。虽然基质干细胞的研究为组织再生和分化提供了有希望的材料来源，但其应用研究还存在不少的技术问题。首先，这些细胞在骨髓细胞中的含量很低(只占大约1/100,000)，从而增加了获得并分离细胞的难度和成本。另外，传统的骨髓穿刺方法也不可避免地给供体带来某些疼痛和术后不适。再者，这些细胞的采集和培养也比较困难。因此，本领域特别需要进一步提供来源普遍、无须对培养材料进行过多预筛选的多能干细胞来源，以及由之衍生其他体细胞和结缔组织细胞的方法。这样，人们未来就有可能利用组织工程技术，已有可能借助基质网架或无细胞支架，使细胞按照限定的三维空间结构生长和繁殖，以再生整个组织甚至器官。中国专利申请00807461号公开了衍生于人脂肪组织的干细胞(ADSC)和网架(结缔组织干细胞)及其克隆群体。该专利申请进一步涉及通过扩充和培养所说的干细胞以产生有用的生物学活性物质和条件培养基的方法，以及由之产生分化的组织和结构的方法。其中所用的培养基是含血清的F12培养基和标准培养基的混合物。在此现有技术基础上，如果能够进一步改善未分化干细胞的培养基和培养条件，将会在一定程度上改善衍生于成人脂肪组织的多潜能干细胞的增殖和扩充速度以及细胞活力，为所说的干细胞的进一步定向分化和其在组织工程或基因治疗中的应用提供必要的细胞准备。专利技术的目的本专利技术的一个目的是提供一种培养和增殖衍生于人脂肪组织的多潜能干细胞的方法，该方法包括(1)提供从3-18岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；(2)提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；(3)于未分化条件下，在步骤(1)得到的条件培养基中传代培养步骤(2)得到的干细胞以进一步纯化之；(4)分离步骤(3)得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的少年人和成人可以是同一或不同个体。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的脂肪组织是通过吸脂手术得到的。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的条件培养基是在普通DMEM培养基中传代培养少年儿童脂肪组织衍生的干细胞后得到的。专利技术的详细内容本专利技术涉及脂肪组织来源的干细胞，更具体地说，本专利技术涉及一种在细胞未分化条件下以较高的增殖速率培养成人脂肪组织衍生的干细胞的方法，特征在于所说的干细胞是在含有血清的条件培养基中维持并增殖的，其中所说的条件培养基是经培养婴幼儿脂肪组织衍生的干细胞得到的。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的方法包括以下步骤(1)提供从3-18岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；(2)提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；(3)于未分化条件下，在步骤(1)得到的条件培养基中传代培养步骤(2)得到的干细胞以进一步纯化并之；(4)分离步骤(3)得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的少年人和成人可以是同一或不同个体。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的脂肪组织是通过吸脂手术得到的。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的条件培养基是在普通DMEM培养基中传代培养少年儿童脂肪组织衍生的干细胞后得到的。为了得到ADSC，一种优选的材料来源是人吸脂手术得到的吸出物。在保证细胞存活的前提下无菌收集所说的吸出物后，首先用含胶元酶(10-40μg/ml)的等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗组织以除去残余的游离脂质和血液。然后可用搅拌和/或用酶(例如胰蛋白酶或胶元蛋白酶)水解方法解离组织，以从脂肪结缔组织基质中释放出游离的脂肪细胞。由于成熟脂肪细胞的BUOYANT密度较低，所以通常浮在等渗缓冲溶液的上层；ADSC将沉淀到溶液下层；而中间层则包括结缔组织基质和脂肪细胞聚集体。可以使用平衡密度离心等方法很容易地分离得到富含脂肪细胞群体的部分(下层)，并使用荧光活化的细胞筛分、水或去污剂洗涤、过滤和有机溶剂提取等方法浓缩去除了脂肪细胞的结缔组织基质部分。可以利用红细胞的渗透敏感性，以在高张盐溶液中保温等方法破坏并除本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周新宇，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：