人胚胎干细胞衍生的软骨细胞前体制造技术

本发明专利技术提供了一种系统，通过分化灵长类多能干细胞获得软骨细胞谱系的细胞。该方法涉及将细胞以微团或其它聚集物形式，在促进生长出所需细胞类型的分化剂混合物中培养。子代能合成Ⅱ型胶原酶或聚集蛋白聚糖，或其它作为软骨细胞谱系特征的产物。根据本公开内容获得的软骨细胞和软骨细胞前体细胞适合用于研究和临床治疗。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及细胞生物学、胚胎干细胞和细胞分化。公开了新来源的具有软骨细胞特征的分化细胞。相关申请的引用本申请要求2001年12月7日提交的美国临时申请号60/339,043的优先权。背景软骨细胞退化是两类疾病的特点骨关节炎，一种变性性疾病，和类风湿性关节炎，它主要是由于炎症引起的。退化导致关节疼痛和运动能力受损到不可忽视的残疾程度。在最近二十年来，在有效抑制疾病发展的消炎药的开发上已经得到了可观的进步。但是，退化总是在发生，需要新的疗法来辅助关节软骨的再生。在再生性药物领域，近来的努力针对开发能修复软骨的细胞群。国际专利出版号WO96/18728报道建立了关节软骨细胞谱系。WO98/55594报道了软骨细胞生长和分化的方法。WO00/27996报道了软骨细胞样细胞的无血清培养基，含有极限必需培养基、生长因子、脂类和氨基酸。美国专利6,150,163(Genzyme)描述了软骨细胞培养基配方和培养方法，其中在含有TGFβ和胰岛素或胰岛素样生长因子的培养基中培养去分化的人关节软骨细胞。Jorgensen等(Ann.Rheum.Dis.60305，2001)综述了干细胞在修复关节炎中的软骨和骨方面的最新进展。Jakob等(J.Cell.Biochem.2681，2001)研究了特别的生长因子，它们与成年人关节软骨细胞扩增和再分化有关。这种扩增和再分化增强了软骨发生和软骨形成。M.Brittberg(Clin.Orthop.367 SupplS147，1999)综述了目前的软骨细胞移植方法，其中自体收集纯软骨细胞或其它间充质细胞，或者作为健康组织来源的异体移植物体外扩增，然后以高密度移植到缺损中。尽管这些临床方法取得了初步的成功，但明显目前软骨细胞来源不足，不能治疗目前临床上大部分的软骨退化病例。Kramer等(Mech.Dev.92193，2000)报道了可通过骨形态发生蛋白(BMP-2和BMP-4)调节小鼠胚胎干细胞，以产生用Alcian蓝染色(软骨细胞特征)，并表达转录因子scleraxis的细胞。令人遗憾的是，胚胎干细胞开发的小鼠模型本身是一个特例，不能得到能用于其它物种分化的策略。事实上，仅有很少的几种其它哺乳动物物种可重复的分离多能干细胞。仅最近Thomson等从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282114，1998)。目前，Gearhart和同事从胎儿性腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998)。不同于用白血病抑制因子(LIF)就可简单从分化中维持鼠胚胎干细胞，人胚胎干细胞必需在非常特殊的条件下维持(美国专利号6,200,806；WO99/20741；WO01/51616)。因此，需要开发全新的方法，将人多能细胞分化成全功能的分化细胞类型。专利技术概要本专利技术提供一种有效生产灵长动物细胞的系统，所述细胞是由多能细胞分化成的软骨细胞谱系的细胞。本文描述了适合研究和治疗的相当富集的软骨细胞群。本专利技术的实施方式之一是分化灵长动物多能干细胞(pPS)分化而获得的含软骨细胞的细胞群。示范性的pPS细胞是人胚胎干细胞。可通过从内源基因合成II型胶原或聚集蛋白聚糖的能力来鉴定软骨细胞谱。优选该细胞群含有少部分能合成弹性软骨、纤维软骨、肥大软骨或骨细胞。本专利技术的另一个实施方式是一群软骨细胞祖细胞，它们在体外培养物中增殖，是通过pPS细胞分化得到的，并能形成具有成熟软骨细胞特征的子代。软骨细胞子代不再是多能的，但负责软骨细胞发育途径。优选使得在该细胞群中未分化的多能细胞的比例最少化，任何剩余的未分化的细胞不负责在进一步增殖后形成软骨细胞。可任选的，可通过增加端粒酶活性增进干细胞的复制能力。本专利技术的另一个实施方式是一种获得本专利技术的细胞群的方法，包括分化pPS细胞(例如，通过形成胚状体)，然后将分化细胞与软骨细胞分化因子的混合物一起培养，例如用微团(micromass)培养。本公开内容下文更详细描述了合适的因子，包括转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、生长和分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白(BMP)、刺猬蛋白(HH)、L-抗坏血酸、和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)。本专利技术的另一种实施方式是一种产生软骨的方法，包括在产生结缔组织蛋白的条件下培养本专利技术的细胞群。本专利技术的另一个实施方式是筛选一种化合物的方法，该化合物能调节软骨生长、分化或软骨成分的合成，该方法包括将该化合物与本专利技术的一群细胞一起培养，并确定其影响效果。本专利技术的另一个实施方式是一种药物组合物，用于在体内产生、修复或维持软骨，该药物组合物包含本专利技术的一群细胞-该药物是用于在个体内，例如在美容手术或关节创伤、关节炎或骨关节炎的治疗中重建软骨。将在下面的描述中进一步阐明本专利技术的这些和其它实施方式。专利技术详述本专利技术解决了如何从多能干细胞进行有效分化，产生大量生产人软骨细胞的问题。可通过首先引发一般分化技术，诱使多能干细胞(pPS)，例如人胚胎干(hES)细胞遵循软骨分化途径，然后在促进软骨细胞生长的因子存在下培养，进行分化过程。开发了一种方法，帮助优化用于有效产生软骨细胞谱系的因子组合。本专利技术的该技术是针对产生一群细胞，富含能通过合成结缔组织成分，例如II型胶原和聚集蛋白聚糖在体内模拟软骨的细胞。开发从hES细胞有效产生软骨细胞的方法是重要的，因为hES细胞可引起无限增殖。因此，本专利技术提供了一种系统，用于产生没有数量限制的软骨细胞。下面的公开内容详细描述了如何制备本专利技术的软骨细胞。详细说明了这些细胞如何用于研究和药物开发。该公开内容还提供了用pPS衍生的软骨细胞再生和重建软骨，以恢复关节运动能力和用于美容目的的药物组合物、装置和治疗方法。定义就本专利技术的目的而言，除非另外说明，术语“软骨细胞”指任何来自软骨细胞途径的细胞。这包括能通过合成II型胶原和聚集蛋白聚糖模拟软骨的成熟细胞。还包括负责形成成熟软骨细胞的能自我更新的祖细胞。就细胞个体发育而言，形容词“分化的”是相对而言的。与对照细胞相比，术语“分化细胞”是一步沿着发育路径进行的细胞。“分化剂”在本文中指用于本专利技术培养系统产生属于软骨细胞系的分化细胞(包括前体细胞和终末分化细胞)的化合物。对此类化合物的作用方式没有限定。例如，所述分化剂辅助分化的过程可以是通过诱导或辅助表型改变、促进具有特定表型的细胞生长或抑制其它细胞的生长。分化剂还可以是其它因子的抑制剂，所述其它因子存在于培养基中或由细胞群合成，否则可能将分化引向非期望的细胞类型。原型“灵长动物多能干细胞”(pPS)是来自受精后任何时间的胚前、胚或胎组织的多能细胞，其特征在于能够在合适的条件下产生数种不同细胞类型的子代，它们来自全部三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的，这可根据标准试验例如在8-12周龄SCID小鼠内形成畸胎瘤的能力来确定。该术语包括各种类型的已建立的干细胞系和根据上述方式确认为是获得自初级组织的多能细胞。PPS细胞的定义包括各种类型的胚胎细胞，例如人胚胎干细胞(hES)，见Thomson等(Science 2821145，1998)；其它灵长动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(Thomson等，Proc.本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过分化灵长类多能干细胞获得的细胞群，其特征在于，至少５％细胞从内源基因合成Ⅱ型胶原或聚集蛋白聚糖。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RS西斯，
申请(专利权)人：杰龙公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]