人体组织工程皮肤的制备方法技术

一种人体组织工程皮肤的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：　　　　（１）人体表皮角元细胞的制备　　　　将新鲜离体人体皮肤０．８－１．２平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡２－４分钟，重复２－４次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入表皮细胞培养液，置于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中，培养２０－２４小时；剪碎至０．０５～０．１平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入表皮细胞培养液，置于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中，每２－４天换培养液１次，１０－２５天后可收集细胞；　　　　（２）成纤维细胞的培养制备　　　　将新鲜离体人体皮肤０．８－１．２平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡２－４分钟，重复２－４次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入成纤维细胞培养液，置于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中，培养２４－２８小时；剪碎至０．１～０．４平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入成纤维细胞培养液；置于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中，８－１０天后可长出成纤维细胞，再８－１０天后可进行分盘培养，共可培养５～６代；　　　　（３）溶液的配制　　　　表皮细胞培养液的配制：甲液：加入０．１－０．５毫克／毫升的表皮细胞特异生长因子，０．５－２毫克／毫升清蛋白，０．４－０．６毫克／毫升透明质酸，０．６－０．９毫克／毫升硫酸软骨素，０．００１－０．０１毫克／毫升白细胞介素，０．００１－０．００８毫克／毫升干扰素，０．００２－０．０１毫克／毫升胰岛素，０．００１－０．００５毫克／毫升甲状腺素，０．００２－０．００８毫克／毫升霍乱毒素；乙液：取８份含１５－２０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养基与２份Ｆ１２培养基混合；最后取１份甲液与９份乙液混合均匀；　　　　成纤维细胞培养液的配制：丙液：加入０．１－０．８毫克／毫升的成纤维细胞特异生长因子，０．６－６毫克／毫升弹性蛋白，０．４－０．６毫克／毫升透明质酸，０．６－０．９毫克／毫升硫酸软骨素，０．００１－０．０１毫克／毫升白细胞介素，０．００１－０．００８毫克／毫升干扰素，０．００２－０．０１毫克／毫升胰岛素，０．００１－０．００５毫克／毫升甲状腺素，０．００２－０．００８毫克／毫升霍乱毒素；丁液：取８份含１５－２０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养液与２份Ｆ１２培养液混合；最后取１份丙液与９份丁液混合均匀；　　　　（４）基质凝胶的形成　　　　将浓度为３毫克／毫升的Ⅰ型猪胶原蛋白８份，１０倍浓度Ｆ１２的培养液１份，０．１摩尔浓度的氢氧化钠溶液０．５份，在冰浴中混合后，加入０．５份含３×１０↑［６］的成纤维细胞的Ｆ１２培养液；然后分别取上述５－６毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到１００毫米滤膜培养皿中，置于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中，使其凝固；再加ＤＭＥＭ培养液，于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中培养７－１０天；　　　　（５）复合皮肤的培养　　　　将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加表皮细胞培养液，放入恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳的环境中培养，每２－４天换培养液１次，７－１０天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用表皮细胞培养液，再培养１０－１５天；　　　　（６）保存与运输　　　　将培养成熟的复合皮肤置于表皮细胞培养液的琼脂固体培养基上，于恒定３７℃，９５％氧气和５％二氧化碳保存箱内运输。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，它是由具生物活性的人体表皮角元细胞及真皮成纤维细胞培养而成的，具有与人体皮肤十分类似的组织结构。可在临床上应用于治疗难愈性糖尿病性足底溃烂，静脉性溃疡以及烧伤，烫伤等皮肤创伤。
技术介绍
根据中华医学会糖尿病病分会的最新流行病学调查资料，我国有近4000万糖尿病患者，其常见慢性并发症之一是糖尿病性足底溃烂，应用常规的清创和盐水敷裹治疗，伤口愈合缓慢，愈合率低。而应用清创及该专利技术的人工皮肤移植治疗，伤口愈合时间明显缩短，愈合率明显提高。此外，我国烧伤病人的数目也十分惊人，达数十万之多。深度烧伤创面的修复往往需要植皮。目前，对小面积深度烧伤多采用自体皮肤移植，然而，大面积深度烧伤时，自体供皮困难，采用结构与功能和人体皮肤十分相似的人工皮肤移植，是最优选择。与自体皮肤移植一样，人体组织工程皮肤移植可促进创面的愈合，减少体液丢失，减少疤痕的形成，避免感染，减轻痛苦，并使创面皮肤得以早期修复。在过去的十年里，人工皮肤的研究和制备技术不断深入和提高。虽有与本专利技术比较接近的现有技术专利，但其人体复合皮肤由培养的角元细胞表皮层及成分多元的基质凝胶和培养的成纤维细胞形成的真皮层组成。这种复合皮肤有其优点。但它存在以下缺点真皮基质形成过程中使用的成分多元，包括胃蛋白酶，壳多糖，弹性蛋白，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸肝素，以及纤维粘连蛋白等，溶液种类繁多，而且工序十分复杂，特别是使用人胶原，取材困难，容易引发免疫疾病，造价昂贵，不利于大量生产及推广应用，至今未见有临床应用报导。另有专利文献JP97,173,362，于1997年7月8日公开的日本专利。其基质材料为胶原，甲壳素，壳多糖，明胶，透明质酸，硫酸软骨素和聚乙醇酸，细胞源自哺乳动物皮肤，经培养，冻干后制作的皮肤虽可长期保存，但它存在着以下缺点利用氨气中和制作的胶原凝胶，不利于细胞的生长发育；抵抗胶原酶消化和抗感染能力较差；由於细胞培养的时间过短，培养出的人工皮肤在其结构上与天然皮肤有较大差距，临床应用效果不佳；且基质成分复杂。
技术实现思路
本专利技术提供了一种，包括人体表皮角元细胞及成纤维细胞的培养制备，溶液的配制，基质凝胶的形成及复合皮肤的培养。其基质原料和工艺技术都有别于现有技术，弥补了现有技术的不足。本专利技术的人体组织工程皮肤无论在生物学及物理学特征上，还是在组织学检查及临床结果方面都比现有技术要好，可大批量生产，并可直接应用于临床。本专利技术是由以下技术方案来实现的。它包括下述步骤(1)人体表皮角元细胞的制备将新鲜离体人体皮肤0.8-1.2平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡2-4分钟，重复2-4次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入表皮细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，培养20-24小时；剪碎至0.05～0.1平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入表皮细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，每2-4天换培养液1次，10-25天后可收集细胞；(2)成纤维细胞的培养制备将新鲜离体人体皮肤0.8-1.2平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡2-4分钟，重复2-4次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入成纤维细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，培养24-28小时；剪碎至0.1～0.4平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入成纤维细胞培养液；置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，8-10天后可长出成纤维细胞，再8-10天后可进行分盘培养，共可培养5～6代；(3)溶液的配制表皮细胞培养液的配制甲液加入0.1-0.5毫克/毫升的表皮细胞特异生长因子，0.5-2毫克/毫升清蛋白，0.4-0.6毫克/毫升透明质酸，0.6-0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.001-0.01毫克/毫升白细胞介素，0.001-0.008毫克/毫升干扰素，0.002-0.01毫克/毫升胰岛素，0.001-0.005毫克/毫升甲状腺素，0.002-0.008毫克/毫升霍乱毒素；乙液取8份含15-20％小牛血清的DMEM培养基与2份F12培养基混合；最后取1份甲液与9份乙液混合均匀；成纤维细胞培养液的配制丙液加入0.1-0.8毫克/毫升的成纤维细胞特异生长因子，0.6-6毫克/毫升弹性蛋白，0.4-0.6毫克/毫升透明质酸，0.6-0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.001-0.01毫克/毫升白细胞介素，0.001-0.008毫克/毫升干扰素，0.002-0.01毫克/毫升胰岛素，0.001-0.005毫克/毫升甲状腺素，0.002-0.008毫克/毫升霍乱毒素；丁液取8份含15-20％小牛血清的DMEM培养液与2份F12培养液混合；最后取1份丙液与9份丁液混合均匀；所述的表皮细胞培养液配制的甲液中还可以加入0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)和200单位/毫升青，链酶素。所述的成纤维细胞培养液配制的丙液中还可以加入0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)和200单位/毫升青，链酶素。(4)基质凝胶的形成将浓度为3毫克/毫升的I型猪胶原蛋白8份，10倍浓度F12的培养液1份，0.1摩尔浓度的氢氧化钠溶液0.5份，在冰浴中混合后，加入0.5份含3×106的成纤维细胞的F12培养液；然后分别取上述5-6毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到100毫米滤膜培养皿中，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，使其凝固；再加DMEM培养液，于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中培养7-10天；(5)复合皮肤的培养将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加表皮细胞培养液，放入恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中培养，每2-4天换培养液1次，7-10天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用表皮细胞培养液，再培养10-15天；(6)保存与运输将培养成熟的复合皮肤置于表皮细胞培养液的琼脂固体培养基上，于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳保存箱内运输。本专利技术与现有技术比较具有如下特点 1)培养液的改进经过一系列的对比试验，本专利技术专门设计出FAD-I型和FAD-II型培养液。除了含有基本的营养成分和因子外，FAD-I型培养液含表皮角元细胞特异生长因子(EKGF)，用于表皮角元细胞的独立培养；FAD-II型培养液则含有成纤维细胞特异生长因子(FBGF)，用于成纤维细胞的独立培养。FAD-I型和FAD-II型二合一培养液则用于复合皮肤的培养。运用FAD-I型和FAD-II型培养液分别培养表皮角元细胞和成纤维细胞，可使这两种细胞的增殖速率显著高于某些报道所使用的DMEM培养液。2)保存和运输本专利技术特别设计的FAD-I型和FAD-II型琼脂固体培养基能够保养滋嫩成熟的复合皮肤达7至10天仍具有完好的生物学活性，可成功地用于植皮。早于报道过的5天。3)凝胶配制本专利技术的凝胶配制使用I型猪胶原蛋白，完全不同于已报道过得人胶原和牛胶原。首先，猪胶原取材极为容易，从而解决了人胶原取材极为不易的难题；猪胶原蛋白的氨基酸组成比例及蛋白质构象比牛胶原蛋白更接近人胶原蛋白，因此，含猪胶原蛋白的人工皮肤更安全更容本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凯，
申请(专利权)人：刘凯，
类型：发明
国别省市：