诱导肿瘤特异性细胞毒性的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及使用条件复制型病毒载体的肿瘤特异性病毒复制和／或表达，所述病毒载体中病毒复制必需基因产物在Ｈ１９调节序列的控制下表达。本发明专利技术提供了所述病毒载体，制备所述载体的方法和所述载体的施用方法。本发明专利技术的组合物和方法可用于治疗癌症和高增殖性疾病。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1.专利
本专利技术属于肿瘤细胞生物学和癌症治疗领域。更具体而言，本专利技术涉及病毒载体在肿瘤细胞中的选择性特异表达。2.
技术介绍
2.1 H19基因H19基因是少数已知的人类印记基因之一(Hurst等，1996，自然遗传学12234-237)。在胚胎发生的最早期，H19在2个染色体等位基因上都表达(DeGroof等，1994，滋养层8285-302)。自此不久，出现父系等位基因沉默，而仅母系遗传的等位基因被转录。H19在胚胎发生期广泛表达，并首先被鉴定为通过反式作用基因座raf在肝中和甲胎蛋白协同调节的基因(Pachnis等，1984，美国国家科学院院报815523-5527)。另外，H19已被许多研究组用目的是分离在组织分化期表达的基因的筛选方法独立克隆。例如，Davis等(1987，细胞51987-1000)在筛选C3H19T1/2细胞的分化过程中早期活性基因时鉴定了H19的小鼠同源物。Pourier等(1991，发育 1131105-1114)发现鼠H19在干细胞分化期间和植入期表达。在人胎盘滋养层细胞分化中也发现了人H19基因的转录(Rachmilewitz等1992，分子生殖发育32196-202)。尽管H19 RNA的转录在整个胎儿期和胎盘发育期许多不同的胚胎组织中发生，H19表达在出生后下调。然而，已有报道H19转录在鼠成年肌肉和肝中为相对低水平(Brunkow和Tilghman，1991，基因和发育51092-1101)。在癌细胞中H19也在出生后活化。Ariel等人(1997，分子病理学5034-44)表明来源于出生前H19表达的组织的许多肿瘤中H19表达升高。另外，这些作者发现来源于神经组织的肿瘤尤其是星形细胞瘤和成神经节胶质细胞瘤中有H19 RNA，其中这被已知与H19的表达无关。鉴于大量癌细胞表达H19 RNA，这些作者推测H19是一种癌胚RNA并建议研究作为人恶性肿瘤的肿瘤标志的H19。已经克隆和测序了人和鼠H19基因(Brannan等，1990，分子细胞生物学1028-36)。比较人和小鼠H19基因显示全长77％的核苷酸序列一致性。尽管种间核苷酸同源性的保守性，根据两种基因的开放读框可预测非常低的氨基酸序列一致性(同上)。而且，虽然H19 RNA被RNA聚合酶II转录，然后拼接和聚腺苷化，但似乎它不被翻译。反之，发现H19 RNA和28S细胞质RNA有关，导致人们推测H19 RNA可能作为核糖核苷酸蛋白的RNA组分起作用(同上)。H19的真正生理作用还没有完全了解。H19能作为一种显性致死基因起作用；H19转基因的高异位表达引起小鼠将要出生前的致死性(Brunkow等，上文)。该致死期恰与H19的表达被抑制的时间相一致。另一个方面，在携带H19敲除等位基因的杂合或纯合的小鼠中，没有观察到缺陷(Leighton等，1995，自然37534-39)。敲除母系遗传的等位基因确实干扰遗传连锁和相反印记IGF-2基因的印记过程；由于增加的出生前IGF-2的表达，得到的小鼠出生时比同窝鼠更大(同上)。因为这2个相反印记基因具有顺式作用的调节序列，Leighton和同事们推测H19可能涉及IGF-2基因的印记。提出的H19基因产物的另一个功能是肿瘤抑制RNA。Hao等人(1993，自然365764-767)报道用H19表达构建体转染的2种胚胎性肿瘤细胞系，RD和G401，导致在裸鼠中细胞生长阻滞，形态改变和降低致癌性。已注意到上述肿瘤抑制活性与小鼠中观察到的异位表达的致死性(Hao等，同上)以及敲除母系H19等位基因的小鼠增加体积(Leighton等，同上)的结果一致。然而，H19是肿瘤抑制因子的建议存在争议。某些结果被报道不能重复，可能存在另一种与H19紧密连锁的候选肿瘤抑制基因(Areil等，同上)。建议的H19作为肿瘤抑制因子的作用还与以下实验数据相抵触，即H19在广泛种类的肿瘤细胞中活化(如见例如Lustig-Yariv等，1997，癌基因23169-177)。2.2 条件复制型病毒正常情况下，病毒编码病毒基因组复制、包装和释放(即从感染宿主细胞中产生子代病毒)所需的全部核酸和肽因子。条件复制型病毒是一种仅在特定条件下复制的病毒。可被制为条件复制的病毒的一个说明性的实例为腺病毒。腺病毒是无包膜的，规则的二十面体。该蛋白外壳(衣壳)由252个壳粒组成，其中240个为六邻体，12个为五邻体。已经使用2和5型腺病毒实施了大多数针对腺病毒多肽的详尽的研究。病毒DNA在2型腺病毒中为23.85×106道尔顿，其大小在不同血清型之间有轻微变化。所述DNA具有末端反向重复，其在各血清型之间具有不同的长度。复制周期分为早(E)期和晚(L)期。晚期确定病毒DNA复制开始。腺病毒结构蛋白通常在晚期合成。腺病毒感染后，在被大多数血清型感染的细胞中宿主DNA和蛋白的合成受到抑制。2型腺病毒和5型腺病毒的腺病毒裂解周期非常有效，结果导致大约10,000病毒体/每个感染细胞，以及过量病毒蛋白和未整合至病毒体中的DNA。腺病毒早期转录是一系列复杂的相关生物化学事件，但实质上必须有病毒DNA复制开始前的病毒RNA的合成过程。腺病毒家族中全部成员的腺病毒基因组的结构相似，且对于已研究的每一血清型而言，其特异性功能通常定位于同样的位置。早期胞质信使RNA与四种已确定的，病毒DNA上的非邻接区互补。这些区域命名为E1-E4。早期转录本被分为即早(immediate early)期(ELa)，延迟早期(ELb，E2a，E2b，E3和E4)和中期(IVA2.IX)区。E1a区参与病毒和细胞性基因以及转录性再表达序列的转录性转活(transactivation)。E1a基因具有对全部其它早期腺病毒信使RNA重要的控制功能。在正常组织中，为了有效转录E1b、E2a、E2b、E3、或E4，需要活化的E1a产物。病毒感染后事件的正常进展中需要E1b区。E1b产物在宿主核内发挥作用。E1b序列内出现的突变表现为后期病毒mRNA的积累的降低以及可在腺病毒感染后正常观察到的宿主细胞输送抑制中的损害。E1b是宿主细胞功能改变所需要的，从而加工和传送移向病毒后期基因产物。然后这些产物导致病毒包装和病毒体的释放。E1b生成的19kD蛋白可以阻止细胞调亡。E1b还生成与p53结合的55kD蛋白。2.3 肿瘤特异的基因治疗来自肿瘤有关的基因的调节序列被用于选择地导向表达在衍生于肿瘤细胞中的自杀基因。例如，在肝细胞癌中诱导甲胎蛋白的表达。Huber等(1991，美国国家科学院院报888039-8043)用来自白蛋白基因或胎儿蛋白基因的控制序列将水痘带状疱疹胸腺嘧啶激酶(VZV TK)基因编码序列在肝癌细胞中导向表达。用含有这些表达构建体之一的逆转录病毒载体感染的肝癌细胞表达VZV TK而变得对正常无毒性的药物原6-甲基嘌呤阿拉伯核苷(araM)敏感。Kaneko等，(1995，癌症研究555283-5287)构建了在甲胎蛋白控调序列控制下表达HSV TK的腺病毒载体。含有该载体的重组腺病毒颗粒被直接注射到在无胸腺裸鼠中产生的衍生于肝细胞癌的肿瘤。接着用更昔洛韦(ganciclovir)腹膜内注射引起衍生于肝细胞癌的肿瘤消退。Osaki等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗癌或高增殖性疾病患者的方法，该方法包括给需要治疗患者施用一种条件复制型病毒载体，其中至少一种编码其复制必需产物的病毒核酸操作性连接于Ｈ１９调节序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A霍克伯格，S亚野斯，
申请(专利权)人：耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]