氧化鲨烯环化酶的晶体结构制造技术

本发明专利技术涉及哺乳动物ＯＳＣ的晶形和从它们得到的晶体结构信息，涉及制备这些晶形的方法以及它们的用途－用于鉴定和／或设计ＯＳＣ活性抑制剂。本发明专利技术的另一个主题是鉴定和／或设计ＯＳＣ活性的抑制剂化合物的方法、通过这些方法鉴定的ＯＳＣ活性的抑制剂化合物和它们在药物组合物中的用途，这些药物组合物用于治疗和／或预防与ＯＳＣ相关的疾病－这些疾病包括高胆固醇血症、高血脂、动脉硬化、血管病、真菌病、寄生虫感染和胆石，和／或治疗和／或预防受损的葡萄糖耐受、糖尿病、肿瘤和／或过度增生性疾病，优选治疗和／或预防高胆固醇血症和／或高血脂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组表达足够量的哺乳动物氧化鲨烯环化酶(OSC)的方法，涉及哺乳动物OSC的晶形和来源于其的三维X射线晶体结构、新结构的建模、OSC配体的结合模式以及基于这些数据的使用进行合理的药物设计的方法。
技术介绍
2，3-氧化鲨烯羊毛固醇环化酶(OSC，E.C.5.4.99.7)是真核细胞中与内质网相关的单中心整合膜蛋白(monotopic integral membrane pntein)。其催化线性三萜(3S)-2，3-氧化鲨烯向稠环化合物如哺乳动物和真菌中的羊毛固醇或植物中的环阿屯醇转化的关键步骤。羊毛固醇是胆固醇和多种类固醇激素的前体。该骨架重排的高度立体选择性和精确性已经引起研究人员的兴趣近半个世纪，并且通过研究此复杂的酶催化的环化级联的机制细节，已经收集到宝贵数据(Viola，F.，等(2000)，合理设计的抑制剂作为比较鲨烯-何帕烯(hopene)环化酶与氧化鲨烯环化酶的工具，Lipids35，297-303)。现在，仍然存在对环化酶的兴趣，因为OSC成为开发抗真菌和低胆甾醇血症药物的靶标(Morand，O.H.等(1997)，Ro 48-8.071，一种降低仓鼠、松鼠猴和小种猪血浆胆固醇的新的2，3-氧化鲨烯羊毛固醇环化酶抑制剂与辛伐他汀的比较，J Lipid Res 38，373-90)。OSC在法呢焦磷酸的下游，在类异戊二烯和辅酶Q的合成之外。在仓鼠中，药理学活性剂量的OSC抑制剂不表现出有害副作用，相反抑制素降低食物摄取和体重并增加血浆胆红素、肝重和肝脏甘油三酯的含量(Morand等，J.Lipid Res.38，1997，373-390)。OSC抑制不引起HMGR的过度表达，因为一种间接的负反馈调节机制参与24(S)，25-环氧胆固醇的生产(Peffley等，Biochem.Pharmaco l.56，1998，439-449；Nelson等，J.Biol.Chem.256，1981，1067-1068；Spencer等，J.Biol.Chem.260，1985，13391-13394；Panini等，J.Lipid Res.27，1986，1190-1204；Ness等，Arch.Biochem.Biophys.308，1994，420-425)。该负反馈调节机制对OSC抑制概念是必要的，因为(i)其与HMGR的间接下调协同地加强了主要抑制效果，和(ii)其防止在肝中大量积累前体鲨烯一氧化物。此外，发现24(S)，25-环氧胆固醇是核受体LXR的最强激动剂之一(Janowski等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA96，1999，266-271)。考虑到24(S)，25-环氧胆固醇是OSC抑制的副产物，推测OSC的抑制也可以间接活化依赖LXR的途径，如(i)胆固醇-7α-水解酶以通过胆汁酸途径增加胆固醇的消耗，(ii)ABC蛋白的表达从而可能刺激反向胆固醇运输并增加血浆HDL-C水平(Venkateswaran等，J.Biol.Chem.275，2000，14700-14707；Costet等，J.Biol.Chem.2000年6月，待出版；Ordovas，Nutr Rev 58，2000，76-79；Schmitz和Kaminsky，FrontBiosci 6，2001，D505-D514)，和/或抑制肠内胆固醇吸收(Mangelsdorf，第十二届动脉硬化症国际研讨会，斯德哥尔摩，2000年6月)。此外，猜测肝脏LXR介导的脂肪酸和胆固醇代谢之间可能存在通讯(Tobin等，Mol.Endocrinol.14，2000，741-752)。因此，抑制OSC的化合物也抑制胆固醇、麦角固醇和其他固醇的生物合成，并降低血浆胆固醇的水平。因此，它们一般可用于高胆固醇血症、高血脂、动脉硬化和血管病的治疗和预防。此外，它们可用于真菌病、寄生虫感染、胆石、胆汁郁积性肝病、肿瘤和过度增生性疾病，例如过度增生性皮肤和血管病的治疗和/或预防。而且，这些化合物也可以治疗性地用于提高葡萄糖耐受性以治疗和/或预防相关疾病，如糖尿病。细菌鲨烯何帕烯环化酶的结构已经在其与抑制剂的复合物中解析了(Lenhart，A.，Weihofen，W.A.，Pleschke，A.E.和Schulz，G.E.，Chemistry &Biology，2002，Vol.9，639-645)。然而，与哺乳动物OSC不同，细菌鲨烯何帕烯环化酶(SHC)为二聚体(Wendt，K.U.，Poralla，K.，Schulz，G.E.，(1997)鲨烯环化酶的结构与功能，Science，277，1811-1815)并且催化与OSC相比具有不同的离析物和产物的反应。因此，哺乳动物OSC和SHC的活性位点区域和底物结合口袋之间具有显著不同，这在设计OSC配体时需要考虑到。膜蛋白像三萜合成酶的研究通常由于细胞中蛋白量较低、不易建立过表达系统、及蛋白具有有限的溶解性和结晶能力而受到阻碍。对于OSC，也只能得到有限量的纯蛋白(Cattel，L.&Ceruti M.(1998)2，3-氧化鲨烯环化酶抑制剂作为研究该酶机理与功能的工具.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.33，353-373)。在大多数情况下，该蛋白从天然来源纯化，如对于大鼠OSC(Kusano，M.，Abe，I.，Sankawa，U.&Ebizuka，Y.(1991)大鼠肝脏鲨烯-2，3-环氧化物羊毛固醇环化酶的纯化和一些性质.Chem PharmBull(东京)39，239-241)。大鼠OSC在酵母中的异源表达只产生少量重组蛋白(Abe，I.&Prestwich，G.D.(1995).大鼠氧化鲨烯环化酶cDNA的分子克隆、鉴定和功能表达，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，9274-9278)。
技术实现思路
因此，本专利技术通过提供重组表达足够量的OSC的方法、OSC的晶形和它们的晶体结构信息，以及制备这些晶体的方法和用这些晶体通过基于结构的药物设计法鉴定和/或设计OSC的抑制剂的方法，解决了鉴定和/或设计OSC活性抑制剂的问题。本专利技术涉及哺乳动物OSC的晶形和从它们得到的晶体结构信息，涉及重组表达足够量的OSC的方法，涉及制备这些晶形的方法，还涉及它们的用途——用于鉴定和/或设计OSC活性的抑制剂。本专利技术的另一个主题是鉴定和/或设计OSC活性抑制剂化合物的方法，通过这些方法鉴定的OSC活性的抑制剂化合物和它们在药物组合物中的用途——用于治疗和/或预防与OSC相关的疾病，这些疾病包括高胆固醇血症、高血脂、动脉硬化、血管病、真菌病、寄生虫感染和胆石，和/或治疗和/或预防受损的葡萄糖耐受、糖尿病、肿瘤和/或过度增生性疾病，优选治疗和/或预防高胆固醇血症和/或高血脂。本专利技术提供了表达、纯化和结晶哺乳动物OSC以形成晶体的方法，该晶体用足够高的分辨率进行X射线衍射可以允许确定OSC或者OSC的一部分或亚结构域的三维结构。该三维结构可用于OSC配体的合理设计。晶体可用于确定潜在配体(例如抑制剂)的结合模式，这可通过将化合物浸入晶体中然后测定复合物的结构来实现。在本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
哺乳动物ＯＳＣ的晶形。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A鲁夫，T舒尔茨加施，R托马，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]