嵌合蛋白质的表型筛选制造技术

一方面，本发明专利技术涉及筛选编码不同人工嵌合蛋白质的核酸文库以鉴定改变细胞或生物体表型特性的嵌合蛋白质。所述嵌合蛋白质可不通过特定靶基因或通路的先验知识而鉴定。一些嵌合蛋白质包括多个锌指结构域并可以诱导，例如，耐热性，溶剂耐受性，改变的细胞生长，胰岛素产生，分化和药物抗性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
大多数基因在转录水平上受结合于基因内、典型地是启动子或增强子区域内的特异DNA位点的多肽转录因子调控。这些蛋白质激活或阻抑RNA聚合酶在启动子上的转录起始，因而调控靶基因的表达。许多转录因子，无论激活子还是阻抑子，结构上均含有具有例如DNA结合，二聚体化，或与转录机制相互作用等特殊功能的独特结构域。转录因子的DNA结合部分本身可以由和DNA接触的单独结构域组成。许多DNA结合结构域，包括锌指结构域，同源结构域，和螺旋-转角-螺旋结构域的三维结构已经被NMR和X一射线晶体学数据确定。效应子结构域例如激活结构域或阻抑结构域在转移到异源转录因子的DNA结合结构域时保留了其功能(Brent和Ptashne，(1985)Cell 43729-36；Dawson等，(1995)Mol.Cell Biol.156923-31)。可以产生锌指结构域的嵌合体的人工转录因子。例如，WO 01/60970(Kim等)描述了确定锌指结构域的特异性和构建识别特异靶位点的人工转录因子的方法。一个关于人工转录因子的申请是去改变特异靶基因的表达。鉴别靶基因中调控区的靶位点，并对人工转录因子进行工程化以识别一个或多个所述的靶位点。当这样的人工转录因子被导入细胞后，他们可以结合相应的靶位点来调节转录。这样控制靶基因表达的策略有时被称为鉴定转录因子的“靶驱动(target-driven)”方法。
技术实现思路
一方面，本专利技术描述了一种方法，其包括(1)提供了一种细胞文库，该文库包含多种细胞，每种细胞均具有表达一种人工嵌合多肽的异源核酸，该多肽包含第一和第二结合结构域，其中第一和第二结合结构域互相异源，并且所述多种细胞中每个成员的第一和第二结合结构域与其他成员是互异的；和(2)鉴别文库中与参照细胞相比发生特性(trait)改变的细胞。结合结构域可以是，例如，独立折叠组件(module)，例如锌指结构域。在许多实施方式中，结合结构域是DNA结合结构域。典型的，参照细胞是不含有文库中的核酸或是含有对照核酸的细胞。参照细胞可以是产生细胞文库的亲代细胞或其衍生细胞。特性可以是任何可探测的表型，例如可被观察到的，选择的，推断的和/或量化的表型。此处使用的嵌合蛋白质包含至少两个互为异源的结合结构域。这两个结合结构域可以来自不同的天然产生的蛋白质。这两个区域也可以来自相同的天然产生的蛋白质，但是与相应的天然产生的蛋白质相比，它们在嵌合蛋白质中位于不同的构型中。在许多实施方式中，细胞不含有报道基因。换言之，细胞不通过有关由于嵌合多肽的表达使其调控发生改变的靶基因的先验信息而进行筛选。另外，细胞可以含有报道基因作为与特性有关或无关的附加的指示标记。同样，筛选前，可以获知一个或多个靶基因的信息。在另一实施方式中，特性是产生一个化合物(例如天然或人工化合物)。该化合物可以是抗生素，抗增生药物，止痛剂，蛋白质等等。在另一实施方式中，特性是对环境条件，例如重金属，盐度，环境毒素，生物毒素，病原体，寄生虫，其它环境极限条件(例如干燥，热，冷)等等的抗性。在一相关的实施方式中，特性是应激抗性(例如，对热，冷，极端pH，化学药品，如氨，药物，渗透压，和离子辐射)。在另一实施方式中，特性是药物抗性。特性的改变可以是双向的，例如敏感性或增强的抗性。在另一实施方式中，细胞是植物，动物(例如哺乳动物)，真菌，或细菌细胞。对哺乳动物而言，特性可以是细胞增殖，细胞因子、激素或信号分子的产生，细胞信号通路的激活，生理通路(例如葡萄糖动态平衡，代谢，肥胖)的激活。DNA结合结构域可以是，例如，锌指结构域。典型的，文库中核酸的第一个锌指结构域变化多样，文库中核酸的第二个锌指结构域也变化繁多。核酸还可以表达至少一个第三DNA结合结构域，例如第三锌指结构域。每个表达的多肽的锌指结构域可以与不同的天然产生的蛋白质的锌指结构域相同，或者与天然产生的蛋白质不同，例如在DNA接触位置的突变体。天然产生的蛋白质可以是任何真核锌指蛋白质例如，真菌(例如酵母)，植物，或动物蛋白质(例如哺乳动物蛋白质，例如人或鼠蛋白质)。每种多肽可以还包含第三，第四，第五，和/或第六个锌指结构域。每个锌指结构域可以是哺乳动物的，例如人的锌指结构域。任选地，所述多种细胞的核酸编码足够数目的不同的锌指结构域以识别至少10，20，30，40，或50个不同的3碱基对的DNA位点。在一个实施方式中，核酸编码了足够数目的不同的锌指结构域以识别不超过30，20，10，或5个不同的3碱基对的DNA位点。表达自细胞文库的核酸的多肽也可以包括功能性转录调控结构域，例如转录激活、阻抑结构域甲基化结构域，乙酰化结构域，或去乙酰化结构域。而且许多嵌合多肽没有融合到特殊的转录调节结构域中时也是有功能的。编码多肽的核酸可以是可操纵地连接组成性或可诱导的启动子。该方法可进一步包含从鉴定的细胞中分离核酸。该核酸可被测序。核酸编码的多肽可被分离。该方法还可包含鉴定多肽特异识别的核酸结合位点。结合位点可被鉴定，例如通过对序列数据库，特别是调控序列数据库进行计算机字串搜索(string search)或分布图搜索(profile search)，或通过体外选择结合多肽的核酸(例如SELEX)。可分析核酸序列的计算机数据库以确定鉴定的核酸结合位点相似于鉴定的结合位点的出现情况。该方法还可包含分析鉴定的细胞中一或多个内源基因的表达或一或多个内源表达的多肽的水平/活性，例如使用mRNA检测(mRNAprofiling)(例如使用微阵列分析)，2-D凝胶电泳，蛋白质配体(例如抗体)阵列，和/或质谱法。并且，单一或小数目的基因或蛋白质也可被检测。在另一实施方式中，比较表达受鉴定的嵌合多肽表达改变的基因的调控区来鉴定可以决定因嵌合多肽的表达直接或间接导致的协调调控的候选位点。该方法还可包括培养细胞以产生可改变的特性。例如，如果改变的特性是增加产生代谢物，该方法可包括培养细胞以产生代谢物。该细胞可以来自于文库，或者是导入了编码嵌合多肽核酸的细胞。嵌合多肽的表达可被调节，例如通过可诱导的启动子，以便可细微地区分特性，或者与另一个条件启动子区分(例如细胞类型特异启动子)。含有编码嵌合多肽核酸的细胞可被导入生物体(例如离体处理)，或用于产生转基因生物。在一实施方式中，至少一些文库成员编码了具有不同调控结构域的蛋白质。例如，一些文库成员可以包括激活结构域，而其它成员包含抑制结构域。例如，在某种情况下文库中DNA结合结构域的特定组合可表示为与激活结构域融合，在另一种情况下，与阻抑结构域融合。在另一实施方式中，一些文库成员包含激活结构域，然而其它不含有调控结构域。以下是一些示范表型扩增干细胞群(例如造血干细胞，神经干细胞，表皮干细胞，或脐带血干细胞)和其它在体外扩增能力有限的细胞；抑制干细胞的分化；细胞(例如分化细胞或干细胞)的多能性增加；改变的应激抗性(例如对环境条件如热，冷，极端pH，化学试剂如细胞培养中产生的氨，药物，盐(渗透压)，离子辐射等抗性增加或降低)；对离子辐射或毒性试剂(例如抗肿瘤药物细胞)敏感性增加，例如肿瘤细胞中敏感性升高；支持病毒感染/复制(例如丙型肝炎病毒的复制)；抗病原体，例如病毒，细菌，或原生生物的能力；细胞内RNAi效率的增加；转化效率的增加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的细胞，其包含编码人工转录因子的异源核酸，该人工转录因子使得所述修饰的细胞相对于与修饰的细胞基本相同但缺少所述异源核酸和人工转录因子的参照细胞具有应激抗性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金晋秀，朴卿顺，李东起，薛媛基，李镐琳，李成一，梁效荣，李良顺，张永纯，
申请(专利权)人：图尔金株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]