用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(ES)细胞系的组合物制造技术

本发明专利技术描述了用于分离、维持或生长多能及具哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的方法。本发明专利技术的组合物是指含有下列成分的组合物：１）经表达有限量白血病抑制因子（ＬＩＦ）的细胞系条件培养基，２）来自被哺乳动物ＬＩＦ转染的细胞系的条件培养基，以及３）添加了重组兔ＬＩＦ的培养基。本发明专利技术还描述了用于分离、维持或生长成年人干细胞和／或成年早期祖细胞的组合物，优选在无基质及不额外添加ＬＩＦ和／或细胞因子或生长因子的条件下培养。本发明专利技术的培养基可用于培养或制备现在还无法获得的多能和具哺乳动物种系感受态胚胎干细胞。本发明专利技术的培养基也可用于培养或制备成年人干细胞和／或成年早期祖细胞。本发明专利技术还涉及新型兔ＬＩＦ、编码兔ＬＩＦ的核苷酸以及在毕赤酵母表达系统中表达重组兔ＬＩＦ的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新型组合物及其在多能干细胞和种系感受态胚胎干细胞的分离、维持或生长中的应用。本专利技术还涉及用组合物培养产生的ES细胞以及这些ES细胞系在种系传递及制备基因改造的非人动物中的应用。本专利技术还涉及新型组合物及其在成人干细胞(ASC)的分离、维持或生长中的应用。
技术介绍
胚胎干细胞ES细胞系是从胚泡的内细胞团(ICM)中分离出的细胞系，这些细胞在特定条件下可以维持很多代，就是说以一定的时间间隔将这些细胞接种到新的培养皿中其多能性不会丢失。它们能保持正常的核型，外源DNA可以重组(同源的或非同源的)到染色体DNA中，从而使目的基因稳定整合。但是到目前为止，种系传递，即ES基因组传递到下一代也只在某些种系的鼠ES细胞系中完成。鼠胚胎干细胞的首次分离是于1981年。从那以后，已建立了几种ES细胞系，现在已被广泛而成功地用于在鼠基因组内导入靶向突变及其他基因修饰。现在所用的大多数有种系形成能力的ES细胞系都来自于129品系，其他的ES细胞系来自于另外的几个饲养品系(C57BL/6及其杂交品系)。而且，即使是129品系，ES细胞系最多也只能在30％的外植胚囊中获得，成功率约为10％，与正常的水平接近。制备嵌合动物最常用的方法是将约10-15个分离的ES细胞注射到宿主胚泡的胚泡腔中，使这些细胞与内细胞团的细胞混和。然后将所得到的嵌合胚泡移植到受体动物体内培养。另外，利用很早期(8-16个细胞)阶段胚胎进行二倍体凝集或四倍体凝集也可以作为ES细胞的宿主。简言之，就是将ES细胞夹在无透明带的早期胚胎之间，培养过夜，然后移植到孵育母体中。这种方法可用于制备嵌合的或完全是ES细胞来源的子代。尽管这些年来ES细胞的培养及嵌合动物的制备技术已有很大提高，但是ES细胞传过几代后其多能性常常降低，并且完全是ES细胞来源的胎儿(通过四倍体凝集制备)在出生后其存活率显著降低。Nagy等，″Derivation of completely cell culturederived mice from early-passage embryonic stem cells″Proc Natl Acad Sci USA1993；908424-8，利用早期几代来源的R1 ES细胞系与四倍体胚胎进行电融合得到凝集体，然后获得了完全是由ES细胞来源的小鼠。但是，这些R1 ES细胞一旦在体外扩增培养就失去了其全能性，因为14代以后来源的ES细胞所产生出的小鼠都无法生存到成年。而且，即使用早期几代的细胞，许多ES-四倍体凝集体在发育成个体前也都死亡了。因此，想要利用晚期传代的ES细胞得到发育正常的ES小鼠是很难实现的，利用基因改造的ES细胞制备ES细胞来源的小鼠好像也是不可能的。最近，Eggan K等，″Hybrid vigor，fetal overgrowth，and viability of micederived by nuclear cloning and tetraploid embryo Complementation.Proc NatlAcad Sci 2001；986209-14证实现在的技术无法利用四倍体凝集的方法从饲养鼠品系的ES细胞获得发育完全的子代。并且发现基因杂合现象是影响通过核克隆或四倍体胚胎互补制备的ES细胞来源的子代存活的一个关键因素。利用任何一种方法制备的培养的ES细胞来源的胎儿都会因为呼吸衰竭而于围产期死亡。与此相对应的是，利用任何一种方法制备的F1 ES细胞来源的幼仔大多数(80-85％)都能存活到成年。但是在另一项研究中却发现ES细胞来源小鼠的出生死亡率与所用的细胞系之间没有明显的相关关系。各种细胞系来源的小鼠都会出现出生后死亡现象，包括那些具有不同遗传背景的细胞系。将1037个注射了各种来源ES细胞的四倍体胚胎移植后得到了34只完全ES细胞来源的仔鼠(3％)。但是只有13只(1％)仔鼠长到成年(AmanoT，Kato Y，Tsunoda Y.Comparison of heat-treated and tetraploid Blastocystsfor the production of completely ES-cell-derived mice.Zygote 2001；9153-7)。已经从小鼠之外的其他许多物种中分离出了假定的多能ES细胞，其中包括仓鼠、猪、羊、牛、水貂、大鼠、灵长类、人、鸡、小猿、青鳉和男人(man)。但是只有几个例子(猪、鸡、青鳉)用这些细胞系通过重新注入胚泡培养出了嵌合体动物，但是还远远没有达到种系传递。从预先植入的兔胚泡中分离多能ES细胞系是Graves KH，Moreadith RW，″Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stemcells from preimplantation rabbit embryos″，Mol Reprod Dev 1993；36424-33报道的。这些细胞系可以分化成不同类型的细胞，分别属于不同的所有三个胚层(用体外的标准评价其多能性)。最近的研究表明，这些从Dutch Belted品系来源的细胞系在注射到受体New Zealand White品系的胚泡中可以生出具有明显包被色的嵌合体，证明这些细胞在体内也具有多能性。但是还无法达到种系传递。另外的试验表明嵌合体形成的频率低以及无法达到种系传递可能是由于这些ES细胞经过多次传代后已丢失了多能性。ES细胞在滋养层细胞存在的条件下可以维持在不分化的状态，因为滋养层细胞可以产生各种阻止细胞分化的因子。研究表明有几种细胞因子具有这种效应DIA/LIF(分化抑制活性/白血病抑制因子)、白细胞介素-6联合可溶性白细胞介素-6受体、白细胞介素-11、抑瘤蛋白M、睫状神经营养因子和心脏营养蛋白。现在发现即使没有滋养层细胞利用这类因子也可以至少将ES细胞维持几代。除了小鼠以外，其他物种的ES细胞技术还处于发展之中，除了小鼠以外还没有公开发表的数据报道能在其他任何物种中达到种系传递。重组的白血病抑制因子(LIF)现在已被常规添加到培养介质中用于体外培养从哺乳动物细胞中分离的胚胎干细胞(ES)。这种方法见于US 5,166,065，EP 0380646和WO9001541的权利要求，这些专利文献中的方法也是从以前的文献AU1988P109644(出版日期为1988年8月22日(51-53))发展而来的。重组鼠或人LIF蛋白的纯化和cDNA的克隆是基于其能够诱导鼠单核细胞系M1分化成成熟巨核细胞从而失去克隆形成能力。(重组)蛋白或cDNA(鼠或人突变株)见于US 5,187,077(以及其他几个后续专利，直到2001年7月17日出版的US 6,261,548)和EP 285448，这些专利文献也是根据1987年8月2日出版的文献AU1987 PI1209发展而来的。后来的实验证明LIF与以前所纯化的蛋白和/或生物活性物质具有一致性。Hozumi等人于1980-1986期间的研究纯化出了同质性的因子D，该因子能刺激鼠单核细胞系M1的分化并能抑制其增殖，Tomida M，Yamamoto-Yamaguch本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离、维持或生长哺乳动物多能胚胎干细胞的组合物，所述组合物可使所述干细胞保持在未分化状态至少１０代，所述组合物含有细胞的条件培养基，其特征在于，所述组合物含有少于０．５ｎｇ／ｍｌ的白血病抑制因子（ＬＩＦ）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L斯库恩简斯，
申请(专利权)人：斯路姆X股份有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]