喹啉酸磷酸核糖转移酶表达的调节制造技术

提供了编码植物喹啉酸磷酸核糖转移酶（ＱＰＲＴ醇）的ＤＮＡ，以及含有该ＤＮＡ的构建体。还提供了改变喹啉酸磷酸核糖转移酶表达的方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT酶)以及编码该酶的DNA。特别地，本专利技术涉及利用编码喹啉酸磷酸核糖转移酶的DNA生产具有基因改造烟碱水平的转基因植物，和由此产生的植物。
技术介绍
考虑到烟碱有令人上瘾的特性，生产烟碱水平减少的烟草是令人感兴趣的。此外，在作为转基因受体以表达具商业价值的产品例如药物、化妆品组分或食品添加剂方面，具有极低烟碱生产水平或无烟碱产生的烟草是有吸引力的。已经设计有众多的方法可用于从烟草中除去烟碱。然而，这些方法中的大多数还会除去烟草中除烟碱外的其它成分，从而对烟草质量有不利影响。利用经典的农作物育种技术已经获得了比野生型烟草类植物中烟碱水平更低(约低8％)的烟草类植物。人们期望得到具有更低水平烟碱的烟草类植物和烟草。降低生物学产物水平的方法之一是减少导致该产物产生的生物合成途径中所需酶的量。若受影响的酶天然以限速量(相对于途径中所需的其它酶类)存在，则该酶丰度的任何减少将会导致终产物产量的减少。如果该酶量不是限速量的，为了消除此途径的产物，就必须将其在细胞中的产生量降低到限速量水平。相反地，如果酶的存在量是限速性的，那么此酶活性的任何增加会增加此生物合成途径的终产物。烟碱最初形成于烟草类植物的根中并随后被转移到叶中，并在此贮存。烟碱生物合成中的限制性步骤是由喹啉酸形成烟酸，该步骤由喹啉酸磷酸核糖转移酶(“QPRT酶”)催化。QPRT酶似乎是烟草中由烟酸至烟碱合成途径中的限速酶。见，例如，Feth等，“烟草愈伤组织内烟碱途径中酶活性的调节”，植物(planta)，168，pp.402-07(1986)；Wagner等，“烟草中烟碱途径酶活性的调节”，植物生理学(Physiol.Plant.)，68，pp.667-72(1986)。Nakatani和Malik的美国专利5,369,023和5,260,205中提出，通过反义调节腐败甲基转移酶(putrescencemethyl transferase，PMT酶)的表达来改变烟草类植物中的烟碱水平。在Wahad和Malik的PCT申请WO94/28142中描述了编码PMT的DNA和有义及反义PMT构建体的使用。
技术实现思路
本专利技术首要方面是包括SEQ ID No.1的分离DNA分子；编码具SEQID No.2序列的酶的DNA序列；可与此DNA杂交并编码喹啉酸磷酸核糖转移酶的DNA序列；和由于遗传密码简并性导致与上述DNA不同的DNA序列。本专利技术更进一步的方面是由这种DNA编码的肽。本专利技术另一方面是一种DNA构建体，它含有植物细胞中可操作的启动子和位于该启动子下游并与之可操作连接的编码喹啉酸磷酸核糖转移酶的DNA片段。编码该酶的DNA可以是反义或有义的方向。本专利技术另一方面是通过提供一种已知表达喹啉酸磷酸核糖转移酶的植物细胞，用含有启动子及含编码喹啉酸磷酸核糖转移酶mRNA的序列部分的DNA的外源DNA构建体转化该植物细胞，而制备其喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT酶)表达有所减少的转基因植物细胞。本专利技术另一方面是转基因烟草植物，与未转化对照植株相比，其喹啉酸磷酸核糖转移酶的表达减少。这种植物的细胞内有包含植物喹啉酸磷酸核糖转移酶mRNA的一段编码DNA序列的DNA构建体。本专利技术另一方面是减少植物细胞中喹啉酸磷酸核糖转移酶表达的方法，该方法是通过培养已转化而含有外源DNA的植物细胞进行的，其中外源DNA的被转录链与该细胞内源喹啉酸磷酸核糖转移酶mRNA互补。该互补链的转录降低了内源喹啉酸磷酸核糖转移酶基因的表达。本专利技术另一方面是叶片中烟碱水平减少的烟草植物的制备方法，该方法通过培养细胞中含有外源DNA序列的烟草植物而进行，其中外源DNA序列的被转录链与细胞内源喹啉酸磷酸核糖转移酶的信使RNA互补。本专利技术一方面是喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT酶)表达增加的转基因植物细胞的制备方法，该方法通过向已知表达喹啉酸磷酸核糖转移酶的植物细胞中转入含有喹啉酸磷酸核糖转移酶编码DNA序列的外源DNA构建体而进行。本专利技术另一方面是喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT酶)表达增加的转基因烟草植物，其中该转基因植物的细胞中含有编码植物喹啉酸磷酸核糖转移酶的外源DNA序列。本专利技术另一方面是增加植物细胞中喹啉酸磷酸核糖转移酶基因表达的方法，该方法通过培养已被转化而含有编码喹啉酸磷酸核糖转移酶的外源DNA的植物细胞进行。本专利技术另一方面是叶片中烟碱水平增加的烟草植物的生产方法，该方法通过培养其细胞中含有编码细胞内具功能的喹啉酸磷酸核糖转移酶的外源DNA序列的烟草植物而进行。附图说明图1显示烟碱的生物合成途径。已知受Nic1和Nic2调节的酶活性是QPRT酶(喹啉酸磷酸核糖转移酶)和PMT酶(腐败甲基转移酶)。图2A显示NtQPT1 cDNA(SEQ ID No.1)的核酸序列，其编码序列(SEQ ID No.3)用大写字母表示。图2B提供了由NtQPT1 cDNA编码的烟草QPRT酶推断的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。图3对比了推断的NtQPT1氨基酸序列与深红红螺菌、麻风分枝杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、人和酿酒酵母中的相关序列。图4显示缺失喹啉酸磷酸核糖转移酶的大肠杆菌突变体(TH265)用NtQPT1 cDNA的互补结果。用带有NtQPT1的表达载体转化细胞；表达NtQPT1的转化TH265细胞在无烟酸的基本培养基中能生长，这表明NtQPT1编码QPRT酶。图5比较了在Nic1和Nic2烟草突变体中的烟碱水平和相关的NtQPT1 mRNA稳态水平野生型Burley21(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)；Nic1-Burley 21(nic1/nic1 Nic2/Nic2)；Nic2-Burley21(Nic1/Nic1 nic2/nic2)；和Nic1-Nic2-Burley21(nic1/nic1nic2/nic2)。实心图栏显示mRNA转录水平；影线图栏显示烟碱水平。图6列出随着时间的推移，去梢烟草植物与未去梢对照植物比较的NtQPT1 mRNA相对水平。实心栏显示mRNA转录水平；影线栏显示烟碱水平。具体实施例方式在烟草植物中，烟碱是由烟酸与4-甲基氨基丁醇缩合产生的。导致烟碱产生的生物合成途径见图1。两调节位点(Nic1和Nic2)作为烟碱产生的共显性调节子起作用。Nic单、双突变体根部的酶学分析显示，喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT酶)和腐败甲基转移酶(PMT酶)两种酶的活性与烟碱生物合成水平成正比例关系。烟草组织(根和愈伤组织)中酶活性与烟碱合成的不同能力间的比较显示，QPRT酶活性与烟碱含量直接相关(Wagner和Wagner，植物(Planta)，165532(1985))。Saunders和Bush(植物生理学(Plant Physiol)64236(1979))的研究显示，在低烟碱突变体根部的QPRT酶水平与叶片中烟碱水平成比例关系。本专利技术包括一新型cDNA序列(SEQ ID No.1)，它编码具SEQ IDNo.2序列的植物喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT酶)。因为QPRT酶活性与烟碱含量严格相关，构建与野生型植物内水平相比其根部QPRT酶水平降低的转基因烟草植物后，会导致植物叶片中的烟碱水平下降。本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含选自下组的序列的一种分离ＤＮＡ分子：（ａ）ＳＥＱＩＤＮｏ．１；（ｂ）编码具ＳＥＱＩＤＮｏ．２序列的酶的ＤＮＡ序列；（ｃ）可与以上（ａ）或（ｂ）的分离ＤＮＡ杂交并编码喹啉酸磷酸核糖转移酶的ＤＮＡ序列 ；和（ｄ）由于遗传密码的简并性使得与以上（ａ），（ｂ），或（ｃ）ＤＮＡ不同的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MA科克林格，N蒙都，宋文，
申请(专利权)人：北卡罗来纳州大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]