一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法技术

一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法，采用电沉积技术在丝网印刷电极表面沉积纳米金，通过静电吸附作用将滴在电极表面的石墨烯、CHER和CHOD吸附到丝网印刷电极表面，胆固醇在CHER和CHOD的作用下水解产生H2O2，H2O2和石墨烯都具有还原性，从而协同催化银沉积，将Ag

A method of detecting cholesterol by CO catalyzed silver deposition of enzyme and graphene

A method of enzyme and graphene catalyzed silver deposition detection of cholesterol by electrodeposition on the screen printed electrode surface deposition of gold nanoparticles by electrostatic adsorption drops on the electrode surface of graphene, CHER and CHOD adsorption onto the screen printed electrode surface, cholesterol hydrolysis in CHER and CHOD. H2O2, H2O2 and have reduced graphene, and synergistic catalytic silver deposition, Ag

【技术实现步骤摘要】
一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测胆固醇的方法。
技术介绍
胆固醇是哺乳动物体内不可或缺的重要物质，人体血清中正常胆固醇水平范围为200mg/dL~239mg/dL。检测方法主要有比色法、重量法、荧光法、热学测定法、分子发光法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、电化学法、动态光谱法和温度测定法。这些传统的检测方法实验费用都较为昂贵。SandroC.等人2008年构建了一种基于碳纳米管和细胞色素P450scc修饰的丝网印刷电极的高灵敏性的胆固醇生物传感器（CarraraS,ShumyantsevaVV,ArchakovAI,etal.Screen-printedelectrodesbasedoncarbonnanotubesandcytochromeP450sccforhighlysensitivecholesterolbiosensors[J].BiosensorsandBioelectronics,2008,24(1):148-150.）。薛茜男等人2010年在丝网印刷金电极的表面使用层层自组装法制备了一层分子印迹膜，研制了一种用于胆固醇检测的生物传感芯片，采用计时电流法检测出传感器的电流响应值，从而实现了对胆固醇的定量检测（薛茜男,边超,任振兴,等.基于分子印迹聚合膜的胆固醇丝网印刷生物传感芯片[J].电子与信息学报,2010,(11):2735-2739）。LeiHong等人2013年合成了一种CuO颗粒，利用该颗粒对H2O2-鲁米诺系统的氧化作用实现了定量检测胆固醇的目的（HongL,LiuAL,LiGW,etal.Chemiluminescentcholesterolsensorbasedonperoxidase-likeactivityofcupricoxidenanoparticles[J].Biosensors&Bioelectronics,2013,85(2):1-5）。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的胆固醇检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法来降低胆固醇的检测限，降低时间和费用消耗，且操作简单。为了解决该技术问题，采用电沉积技术制作的基于石墨烯和酶协同催化银沉积的胆固醇电化学生物传感器，印刷电极上的酶在石墨烯复合材料作用下直接与样品中的胆固醇反应，产生电流信号，通过与标准工作曲线对比得到准确的胆固醇浓度。与现有的方法相比操作相对简单，而且时间和费用的消耗更少，能达到0.001μg/mL的最低检测限低的检测限。本专利技术的检测原理为：采用电沉积技术在丝网印刷电极表面沉积纳米金，通过静电吸附作用将滴在电极表面的石墨烯、胆固醇酯酶（CHER）和胆固醇氧化酶（CHOD）吸附到丝网印刷电极表面，胆固醇在CHER和CHOD的作用下水解产生H2O2，H2O2和石墨烯都具有还原性，从而协同催化银沉积，将Ag+还原成Ag并沉积在丝网印刷电极表面。通过线性扫描伏安法（LSV）检测出Ag的阳极溶出电流，并描绘出该电流与胆固醇浓度的关系曲线，实现对胆固醇的检测。本专利技术按照以下步骤进行：步骤1：丝网印刷电极预处理将电极置于H2SO4溶液中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的丝网印刷电极，用纯水冲洗干净；步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建（1）将活化后的丝网印刷电极置入HAuCl4中，搅拌同时进行恒电位沉积，沉积结束后用清水将电极冲洗干净；（2）取石墨烯（GO），将其置于蒸馏水中，超声分散，得石墨烯（GO）悬浮液。在悬浮液中加入EDC/NHS溶液，加入胆固醇酯酶（CHER）溶液和胆固醇氧化酶（CHOD）溶液，保存备用。（3）在电极表面滴加石墨烯、CHER和CHOD的混合溶液，将电极放在盛满水的烧杯中并用保鲜膜封闭以保湿，将酶和石墨烯固定在电极表面，用甘氨酸-NaOH溶液将固定酶的电极冲洗干净，晾干备用。步骤3：胆固醇的标准曲线绘制（1）在步骤2得到的固定了酶和石墨烯电极表面，滴加胆固醇溶液和AgNO3溶液，反应一段时间，得到沉积有单质银的工作电极，用甘氨酸-NaOH缓冲液将电极表面清洗干净；（2）将电极放入KNO3-HNO3溶液中溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰的电流值；（3）根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制胆固醇的标准曲线，计算灵敏度和检测限。步骤4：待测样品的检测（1）在步骤2得到的固定了酶和石墨烯电极表面，滴加待测样品和AgNO3溶液，反应一段时间，得到沉积有单质银的工作电极，用甘氨酸-NaOH缓冲液将电极表面清洗干净；（2）将工作电极放入KNO3-HNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰的电流值；（3）根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测样品溶液中胆固醇的浓度。进一步，所述步骤1中H2SO4溶液浓度为0.5mol/L。进一步，所述步骤1中扫描电压为-0.2V~1.0V，扫描圈数为10。进一步，所述步骤1中将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描后，用纯水冲洗干净后，再将电极置于铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中分别进行循环伏安扫描，最后用纯水冲洗晾干备用。进一步，所述步骤2中，使用的HAuCl4浓度为0.01%，沉积条件为-0.5V,沉积时间120s。进一步，所述步骤2中，石墨烯浓度为200μg/mL。进一步，所述甘氨酸-NaOH缓冲液为pH8.6，0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。优选，所述步骤3中AgNO3溶液的浓度为90mmol/L。优选，所述步骤3和步骤4中的线性扫描范围-0.1V~0.6V，扫描速率为100mV/s。其中，步骤1为步骤2提供一个新鲜的电极表面。步骤2中石墨烯和酶在EDC和NHS作用下，构成特异性识别胆固醇的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建为步骤3中胆固醇的电化学检测中必不可少的关键步骤。可见步骤1-3相互支撑，共同作用，才能利用酶和石墨烯协同催化银沉积反应实现电化学检测胆固醇。本专利技术与现有技术相比具有如下优点：1、利用石墨烯和纳米金比表面积大、吸附能力强的特性可以有效地将酶固定到电极的表面，以保证传感器的稳定性，使酶能够更好的与胆固醇接触并催化胆固醇氧化；又利用纳米金良好的导电性，有效地加快传感器电子转移速率，能够提高检测速率和检测能力。2、采用酶和石墨烯协同催化银沉积原理来实现电化学检测胆固醇背景干扰小，能达到0.001μg/mL的最低检测限低的检测限。附图说明图1基于酶和石墨烯协同催化银沉积反应原理检测胆固醇的电化学方法原理图；图2电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；图3电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图；图4传感器在不同浓度胆固醇下的响应电流；图5传感器的工作曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法，检测原理见图1。实施步骤如下：1.电极的预处理：丝网印刷电极在使用之前首先将其置于0.5mol/LH2SO4溶液中，使用循环伏安扫描法进行扫描，扫描电压为-0.2V~1.0V，在该范围内扫描10圈；扫描结束后用清水将电极洗净，晾干备用；2.电极的修饰和酶的固本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法，按以下步骤进行：步骤1：丝网印刷电极预处理；将丝网印刷电极置于H2SO4溶液中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的丝网印刷电极，用纯水冲洗干净；其特征在于，还包括：步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建将活化后的丝网印刷电极置入HAuCl4中，在磁力搅拌器搅拌的同时进行恒电位沉积，沉积结束后用清水将电极冲洗干净；取石墨烯，将其置于蒸馏水中，超声分散，得石墨烯悬浮液；在悬浮液中加入EDC和NHS溶液后，加入CHER溶液和CHOD溶液，将该混合溶液置于冰箱中冷藏存放；取出，放在‑20℃冰箱中保存备用；在电极表面滴加2 µL石墨烯和CHOD的混合溶液，将电极放在盛满水的容器封闭保湿，在冰箱中冷藏保存1小时，将酶和石墨烯固定在电极表面，用甘氨酸‑NaOH溶液将固定酶的电极冲洗干净，晾干备用；步骤3：胆固醇的标准曲线绘制在步骤2得到的固定了酶和石墨烯电极表面滴加胆固醇溶液和 AgNO3溶液，把电极放置在37°C且避光的环境中，反应时间为30分钟，得到沉积有单质银的工作电极，用甘氨酸‑NaOH缓冲液将电极表面清洗干净；将电极放入0.6 mol/L KNO3‑0.1 mol/L HNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰的电流值；根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制胆固醇的标准曲线，计算灵敏度和检测限；步骤4：待测样品的检测在步骤2得到的固定了酶和石墨烯的丝网电极表面滴加待测样品和 AgNO3溶液，把电极放置在37°C且避光的环境中，反应时间为30分钟，得到沉积有单质银的工作电极，用甘氨酸‑NaOH缓冲液将电极表面清洗干净；将工作电极放入0.6 mol/L KNO3‑0.1 mol/L HNO3溶液中，进行线性扫描，扫描范围‑0.1 V ~ 0.6 V，扫描速率为100 mV/s，记录Ag的溶出伏安峰的电流值。...

【技术特征摘要】
1.一种酶和石墨烯协同催化银沉积检测胆固醇的方法，按以下步骤进行：步骤1：丝网印刷电极预处理；将丝网印刷电极置于H2SO4溶液中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的丝网印刷电极，用纯水冲洗干净；其特征在于，还包括：步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建将活化后的丝网印刷电极置入HAuCl4中，在磁力搅拌器搅拌的同时进行恒电位沉积，沉积结束后用清水将电极冲洗干净；取石墨烯，将其置于蒸馏水中，超声分散，得石墨烯悬浮液；在悬浮液中加入EDC和NHS溶液后，加入CHER溶液和CHOD溶液，将该混合溶液置于冰箱中冷藏存放；取出，放在-20℃冰箱中保存备用；在电极表面滴加2µL石墨烯和CHOD的混合溶液，将电极放在盛满水的容器封闭保湿，在冰箱中冷藏保存1小时，将酶和石墨烯固定在电极表面，用甘氨酸-NaOH溶液将固定酶的电极冲洗干净，晾干备用；步骤3：胆固醇的标准曲线绘制在步骤2得到的固定了酶和石墨烯电极表面滴加胆固醇溶液和AgNO3溶液，把电极放置在37°C且避光的环境中，反应时间为30分钟，得到沉积有单质银的工作电极，用甘氨酸-NaOH缓冲液将电极表面清洗干净；将电极放入0.6mol/LKNO3-0.1mol/LHNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰的电流值；根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制胆固醇的标准曲线，计算灵敏度和检测限；步骤4：待测样品的检测在步骤2得到的固定了酶和石墨烯的丝网电极表面滴加待测样品和AgNO3溶液，把电极放置在37°C且避光的环境...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，曾俊翔，崔丽杰，李桂银，梁晋涛，董辰杨，王志宏，周治德，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：广西,45