一种分离的盐生杜氏藻烯醇酶，其特征在于，该酶选自下组： （ａ）具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸序列的多肽； （ｂ）将ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有烯醇酶功能的由（ａ）衍生的多肽。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学领域，具体地说，本专利技术涉及新的编码盐生杜氏藻(Dunaliella salina)耐盐相关蛋白-烯醇酶的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本专利技术还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本专利技术的多肽是一种新的耐盐相关蛋白。
技术介绍
目前，世界人口不断增加，而可耕种土地却不断减少。然而，地球上还有许多因盐碱化而无法有效利用的土地资源。为了有效地利用这些盐碱化的土地资源，人们一直在寻找既适应生长而具有较高经济价值的植物品种。然而，迄今为止没有十分合适的植物品种。另一种开发耐盐碱植物的方法是对已有的植物品种，尤其是具有较高经济价值的植物品种进行改良。然而，传统的植物改良方法费时、费力、并且缺乏针对性。为了有效地、针对性地改善植物品种的耐盐性，本领域迫切需要开发与耐盐性有关的基因和蛋白。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种新的盐生杜氏藻耐盐相关蛋白烯醇酶以及其片段、类似物和衍生物。本专利技术的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在提高植物耐盐性方面的用途。盐生杜氏藻(Dunaliella salina)属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，主要生长于高盐度水体中。细胞形态通常为卵圆形，当外界渗透压发生变化时，其形态可变为球形至纺锤形。它具有两条等长的鞭毛和一个杯状叶绿体，在叶绿体的外缘可积累大量的β-胡萝卜素小滴，是细胞呈橙红色。细胞无细胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。盐生杜氏藻与衣藻(Chlamydomonas)具有较近的亲缘关系。本专利技术人通过多年对盐生杜氏藻的研究，发现了盐生杜氏藻中与耐盐性有关的蛋白-烯醇酶，在此基础上完成了本专利技术。在本专利技术的第一方面，提供新颖的分离出的烯醇酶，该酶源自盐生杜氏藻的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该酶选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有烯醇酶功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，该酶是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。在本专利技术的第二方面，提供编码分离的盐生杜氏藻烯醇酶的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性(a)编码上述盐生杜氏藻烯醇酶的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1437位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1440位的序列。在本专利技术的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。在本专利技术的第四方面，提供了制备盐生杜氏藻烯醇酶的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出盐生杜氏藻烯醇酶。在本专利技术的第五方面，提供了与上述的盐生杜氏藻烯醇酶特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1440个核苷酸。在本专利技术的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗盐生杜氏藻烯醇酶活性的化合物，以及抑制盐生杜氏藻烯醇酶的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。在本专利技术的第七方面，提供了检测样品中是否存在烯醇酶的方法，它包括将样品与烯醇酶的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在烯醇酶。在本专利技术的第八方面，提供了本专利技术多肽和编码序列的用途。例如本专利技术多肽可被用于筛选促进盐生杜氏藻烯醇酶活性的激动剂，或者筛选抑制盐生杜氏藻烯醇酶活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本专利技术的盐生杜氏藻烯醇酶的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。在本专利技术的第九方面，提供了一种改善植物耐盐性的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有烯醇酶DNA编码序列，所述的烯醇酶选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有烯醇酶功能的由(a)衍生的多肽。(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使烯醇酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入烯醇酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。本专利技术的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。具体实施例方式在本专利技术中，术语“烯醇酶(enolase)”、“烯醇酶蛋白”“烯醇酶多肽”或“耐盐相关蛋白烯醇酶”可互换使用，都指具有盐生杜氏藻耐盐相关蛋白烯醇酶氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐盐相关蛋白烯醇酶。烯醇酶催化的反应如下 如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的烯醇酶蛋白或多肽”是指烯醇酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化烯醇酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本专利技术的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本专利技术的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本专利技术还包括盐生杜氏藻烯醇酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本专利技术的天然盐生杜氏藻烯醇酶相同的生物学功能或活性的多肽。本专利技术的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本专利技术中，术语“盐生杜氏藻烯醇酶”指具有盐生杜氏藻烯醇酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与盐生杜氏藻烯醇酶相同功能的、SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹毅，唐克轩，蒋彦，杨滔，曾昌耀，
申请(专利权)人：四川川大光耀生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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