一种建立非随机Ribozyme库和非随机DNAzyme库的方法技术

本发明专利技术提供了一种建立非随机Ｒｉｂｏｚｙｍｅ库和非随机ＤＮＡｚｙｍｅ库的方法；这种方法的实施包括以下功能性的步骤的１的从任意目标序列中截取一定长度的序列片段片２片在实验需要的情况下，从１中选择出具备一定序列特征的序列片段的亚群；３，对被截取的序列片段进行修饰，其中包括删除不必要的碱基、插入和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ分子或者ＤＮＡｚｙｍｅ分子的构建相关的碱基序列；４，将经过改造的来自于目标序列的序列片段，克隆进合适的序列环境例如合适的载体体系中，得到可以产生Ｒｉｂｏｚｙｍｅ分子或ＤＮＡｚｙｍｅ分子体系例如合适的表达载体等；由此完成针对任意目标序列的非随机Ｒｉｂｏｚｙｍｅ库和非随机ＤＮＡｚｙｍｅ库的构建，而不同特点的非随机Ｒｉｂｏｚｙｍｅ库和非随机ＤＮＡｚｙｍｅ库则可以被用到不同的具体实验研究中去。本发明专利技术对所提供的方法所依据的原理以及方法的具体实施过程做了详细的说明。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及后基因组时代的基因结构、基因功能及基因型和表型相关性等方面的研究；具体地说，本专利技术提供了一种简单实用的技术原理和技术方法，在这些原理和方法的基础上，可以建立针对任意来源的基因序列建立非随机的Ribozyme库和非随机的DNAzyme库，而后者则为对相应的基因的表达水平的操纵提供了有效的工具；本专利技术提供的方法，为基因结构和功能相关性的研究乃至基因型和表型的相互关系的研究，构成了新的有效的手段。
技术介绍
在包括人类基因组在内的多个物种的基因组序列的测定工作取得重大进展之后，生命科学面临的一个重大的挑战，就是对基因组序列所含有的基因的功能进行研究。而在所有基因功能研究相关的手段中，Ribozyme和DNAzyme被证明是一种非常行之有效的工具(Breaker RR et al，2003；Sun LQ et al，2000)。Ribozyme是一类具有特殊功能的RNA分子，DNAzyme则是一类根据Ribozyme分子的作用机制而在实验室里设计出来的DNA分子，Ribozyme分子和DNAzyme分子都可以通过对目标RNA分子的特异性识别并对目标RNA分子进行特异性的切割，显然，当目标RNA分子属于mRNA分子时，Ribozyme分子和DNAzyme分子则可以在转录的水平上降低甚至阻断相应基因的表达(Breaker RR et al，2003；Sun LQ et al，2000)。Ribozyme在许多基因的功能确定的过程中发挥了重要的作用，近来DNAzyme也发挥了类似的作用。然而，在生命科学发展到后基因组时代的今天，如何使得Ribozyme相关的方法适应于全基因组范围对基因功能的系统研究，就成了一个最值得关注的方向。Ribozyme库显然是可以满足这一需求的工具(Suyama E et al，2003；Rhoades K et al 2003)。目前已报导的Ribozyme库，主要是通过随机合成的方法构建的，即将对应于Ribozyme分子中具有特异识别功能的碱基序列用随机序列代替；这样，至少在理论上，由此得到的Ribozyme库可以和任意可能的作为底物的目标序列结合并产生切割作用(Suyama E et al，2003；Rhoades K et al 2003)；但是，具有随机序列的Ribozyme库却有两个基本点固有的局限其一，效率较低；例如，一个Hammerhead类型的Ribozyme库，其中含有的用于特异性识别的随机序列部分的总的长度，如果需要达到15个碱基，这就意味着一个完整的随机库所代表的不同序列的总和，应是415，即大于1.6×109，而对大多数的研究目的而言，随机库中的相当数量的分子是毫无用处的，这就在无形中增加了无效工作的比例；其二，较难构建含有更长随机序列的Ribozyme库；Ribozyme分子中的特异识别序列的长度，事实上可以有很大的变化，在一些情况下，含有较长特异识别序列的Ribozyme，可能更为有效；但随机序列的总长度的延长，即意味着随机库容量的加大，这就必将给库的维持和应用带来困难。正是由于随机Ribozyme库固有的局限，其在后基因组时代的应用空间也被大大的压缩了。为消除随机Ribozyme库在应用上存在的诸多限制，本专利技术提供了一种直接从目标序列中截取一定长度的片段并以此为基础构建Ribozyme库的方法，利用本专利技术提供的方法得到的Ribozyme库的所有对应的Ribozyme分子，都可以特异性的识别目标序列的某个序列片段；例如，当目标序列是人类基因组表达的所有mRNA分子时，则即使根据目前对人类基因组所含有的基因总数的最大胆的估计，也不会超过十万个，那么，对一个代表量为107的Ribozyme库而言，就达到100∶1的(库容∶底物)比。本专利技术提供的方法，无疑在避免了随机库的缺陷的基础上，大大提高了后基因组时代Ribozyme作为一种基因功能研究工具的应用空间。专利技术概述本专利技术所依据的原理，是利用具备一定特征的外源序列的功能，从任意已知或者未知目标序列中，截取一定长度的短的序列片段，然后对被截取的序列片段加以改造，使之成为能够产生和目标序列中被截取的片段相对应的，即可以对含有被截取片段同样的序列的RNA分子作特异性识别的Ribozyme分子的结构。图1所示，是本专利技术所依据的原理的一般说明。通常情况下，Ribozyme的作用对象，是RNA分子，特殊情况下，一些在Ribozyme基础上开发出来的分子，例如DNAzyme，也可以作用于DNA分子，但在常规的分子生物学操作的意义上，RNA分子显然可以被转换成DNA分子并在此基础上进行操作，例如可以利用非常一般的分子生物学手段，将mRNA转换成cDNA进行操作。图1对本专利技术所依据的原理的一般说明，即在DNA的水平上进行。其所示意的研究目标是从目标序列中截取一定长度的序列片段(图1中位于A、B之间的序列片段)，并通过后续手段，对被截取的序列片段进行删除、插入等操作，并最终将之克隆到含有合适的外周序列结构的环境中去。而这个过程，大体是通过以下的功能性步骤实现的第一步，在目标序列中A点的外侧，引入一段具备一定特征的外源序列，该外源序列至少含有一个SRE位点。SRE位点是一类能够和特殊的识别和催化体系进行作用的序列或者结构。本专利技术中常用的SRE位点，是一类特殊的限制性内切酶的识别位点，其中比较典型的如Type IIS限制性内切酶等，例如BbsI，BseRI，SapI等(Aggarwal AK et al，1998；Richard JR et al，2003)；第二步，利用和外源序列含有的SRE位点对应的识别和催化体系，例如与外源序列中含有的特异识别位点对应的Type IIS限制性内切酶的作用，在目标序列中A、B之间的某个点上形成双链的酶切，同时利用酶切留下的末端将另一段外源序列引入该酶切点，显然，利用这个在A、B之间新引入的外源序列中含有的SRE位点，就可以在目标序列中再引入一级外源序列，对图示所要达到的研究目的来说，类似的过程的重复进行，就是最终在目标序列中A、B序列片段的B点的外侧，引入一段非典型的外源序列，这里所说的非典型的外源序列的含义是在最后B点外侧的含有的外源序列中，可以根据具体的实验，可以含有SRE位点，但也可以不含SRE位点。这样，在经过对各级外源序列及其所含有的SRE位点的功能的连续使用，就可以最终在目标序列的A、B序列片段的B点的外侧形成一个插入。当然，在具体的操作中，图1的示意中位于目标序列的A、B两点之间的所有外源序列将被彻底删除，并在删除的同时，使原来的序列得到完全的恢复；第三步，在第二步工作的基础上，将目标序列中A、B之间的序列片段克隆出来；第四步，对第三步中通过克隆手段截取出来的位于目标序列中A、B之间的序列片段作进一步修饰，根据具体的研究目的，这种修饰可以包括对被克隆的片段两侧或者中间的序列进行的包括删除和/或插入在内的实验所需要的修饰；在图1的示意中，最终得到的，将是含有满足要求的上游序列、中间序列和下游序列的序列片段。值得强调指出的是，图1所示，只是对本专利技术所依据的原理的概要性说明，而针对不同研究需要的具体的实验过程，将会复杂得多。显然，对应于非随机Ribozyme库的构建而本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术提供了一种操作目标序列的方法，其特征是：１）利用一个或者一个以上的与位于外周序列中的ＳＲＥ位点对应的ＳＲＥ酶的酶切作用在目标序列中制造一个断裂点，并在所制造的断裂点的位置上引入一段外源序列；２）至少利用一种ＳＲＥ酶的酶切作用对所引入的外源序列和／或外源序列周围的目标序列做修饰，其中包括对序列的任意部分的删除和／或置换等。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：万海粟，
申请(专利权)人：万海粟，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]