检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，包括针对鸡、鸭、鹅的三重荧光PCR引物探针组，针对鹌鹑、鸽子、石鸡的三重荧光PCR引物探针组，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.14所示。本发明专利技术属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对上述六种禽源性成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于禽类产品的日常检测。

Detection of six avian source components of three PCR fluorescent primer probe set, kit and method

The invention discloses a detection of six avian source components of three fluorescence PCR primer probe sets, including for chicken, duck and goose three fluorescence PCR primer probe sets, according to dove, the three quail, partridge heavy fluorescence PCR primer probe sets, such as Seq.ID No.1 specific to Seq.ID shown in No.14. The invention belongs to the technical field of detection of gene engineering, the primers and probes do not cause interference, only on specific target sequences were amplified and the fluorescence signal, no amplification and fluorescence signal of non target sequences, can achieve accurate inspection of the six avian species components, has the advantages of good specificity, standard error, short detection time, saving the cost of reagents, it is suitable for routine testing of poultry products.

【技术实现步骤摘要】
检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于基因检测
，尤其涉及检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
当前，动物产品的掺假现象频繁发生，国内外屡有此类报道，例如在2013年，欧盟不少国家发生了以马肉冒充牛肉的牛肉食品掺假事件。近年来，我国也陆续曝光了很多动物产品的掺假事件，包括各地食药监、质检、工商所查获和新闻媒体公布的各类案例：以鸭肉冒充羊肉，以猪肉、鸡肉冒充牛肉，以猫肉冒充兔肉等造假手段。由于掺假动物产品绝大部分有添加香精香料、添加调味剂、已经过深加工等迷惑措施，使消费者仅通过观察和感官品评，基本不能辨别，因此食品安全问题堪忧。在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中，通过PCR技术扩增并检测目标动物源性基因，是目前主流的科学依据和技术手段，近年来得到广泛的应用。该技术主要分为两个部分：①提取样品DNA；②DNA的PCR检测。样品中DNA的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。未加工和粗加工食品的DNA损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常DNA纯度OD260/OD280为1.6至1.8，浓度在ng/μL级，可略作稀释或直接用于PCR检测。深加工食品的DNA损失大且碎片化，自动化、半自动化的方法得率较低；通常采用手动提取的方法。因为样品种类、研究方式区别很大，手动提取的方法也种类广泛、差异显著，效果因而参差不齐。第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如20151012723.2《同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒》、201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法》等。目前，尚无文献报道对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡的源性成分同时进行多重PCR的高效检测，因此，提供一种检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组及相关方法具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术针对鸡(Gallusgallus)、鸭(Anasplatyrhynchos)、鹅(Ansercygnoides)、鹌鹑(Coturnixcoturnix)、鸽子(Columbalivia)、石鸡(Alectorischukar)这六种我国常见肉用家禽的基因组设置特异性的引物探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡源性成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，有利于不同品系禽类源性的充分检出。本专利技术在设计六种禽源性成分检测的三重荧光PCR引物探针组和方法时，既考虑了鸡、鸭、鹅等常见市售家禽，也考虑了鹌鹑、鸽子、鹧鸪等市售风味家禽。其中，依据标准SN/T3731.6-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法》、实地走访数家风味家禽饲养场、通过电商网购一些标称“鹧鸪”的肉类，均发现其实为石鸡(Alectorischukar)，又称美国鹧鸪、嘎嘎鸡等，在我国作为风味家禽，饲养规模较广。而我国传统定义中的鹧鸪(Francolinuspintadeanus)，又名中华鹧鸪，目前仍以野生为主。无论从野生动物保护方面，还是风味家禽鉴定领域，石鸡Ale.chukar的鉴定意义远大于鹧鸪F.pintadeanus。设计鸡、鸭、鹅特异性引物和探针时，首先明确其分类学地位。家鸡Gallusgallusdomesticus、家鸭Anasplatyrhynchosdomesticus、中国家鹅Ansercygnoidesdomestica分别是原鸡Gallusgallus、绿头鸭Anasplatyrhynchos、鸿雁Ansercygnoides的驯化种。可见家鹅注明为“中国家鹅”，原因为家鹅主要分为两大类，中国家鹅Ans.cygnoidesdomestica和欧洲家鹅Ans.anserdomestica，欧洲家鹅为灰雁Ans.anser的驯化种，与中国家鹅为同雁属不同种。从本申请件实用目的出发，选择中国家鹅Ans.cygnoidesdomestica为鉴定对象。据分子分类学相关研究，高等物种在野生亚种之间，基因差异就已非常小，通常只有个别基因差异，尤其是驯化亚种，基因组几乎与原野生种无区别。且在各基因组文库中，相关序列的物种来源备注，一般只到属、种；精确到亚种、变种、血清型、突变株的，多为某些致病菌、病毒。因此，本申请件在检索目的基因时，以原鸡属原鸡种G.gallus、鸭属绿头鸭种Ana.platyrhynchos、雁属鸿雁种Ans.cygnoides相关序列为参考依据。检索NCBI的Genbank后获得鸡、鸭、鹅的线粒体相关序列数十条，首先用Lasergenev7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再通过Oligov7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，专利技术人发现根据其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)基因的特定位点可设计一对通用引物和三条特异探针。探针选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，相对TAMRA、BHQ等特异性更强，能有效避免单碱基差异带来的非特异性扩增，确保鉴定结果准确。相对SN/T2727-2010《饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法》中鸡、鸭、鹅的三对引物和三条探针，在试剂成本和操作步骤上，有了一定程度上的优化。设计鹌鹑、鸽子、石鸡特异性引物和探针时，首先明确其分类学地位。家鸽Columbaliviadomestic本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于：包括针对鸡、鸭、鹅源性成分的三重引物探针组A和针对鹌鹑、鸽子、石鸡源性成分的三重引物探针组B；所述三重引物探针组A包括通用上游引物Seq.ID No.1、通用下游引物Seq.ID No.2、鸡源性探针Seq.ID No.3、鸭源性探针Seq.ID No.4、鹅源性探针Seq.ID No.5；所述三重引物探针组B包括鹌鹑上游引物Seq.ID No.6、鹌鹑下游引物Seq.ID No.7、鸽子上游引物Seq.ID No.8、鸽子下游引物Seq.ID No.9、石鸡上游引物Seq.ID No.10、石鸡下游引物Seq.ID No.11、鹌鹑源性探针Seq.ID No.12、鸽子源性探针Seq.ID No.13、石鸡源性探针Seq.ID No.14。

【技术特征摘要】
1.检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于：包括针对鸡、鸭、鹅源性成分的三重引物探针组A和针对鹌鹑、鸽子、石鸡源性成分的三重引物探针组B；所述三重引物探针组A包括通用上游引物Seq.IDNo.1、通用下游引物Seq.IDNo.2、鸡源性探针Seq.IDNo.3、鸭源性探针Seq.IDNo.4、鹅源性探针Seq.IDNo.5；所述三重引物探针组B包括鹌鹑上游引物Seq.IDNo.6、鹌鹑下游引物Seq.IDNo.7、鸽子上游引物Seq.IDNo.8、鸽子下游引物Seq.IDNo.9、石鸡上游引物Seq.IDNo.10、石鸡下游引物Seq.IDNo.11、鹌鹑源性探针Seq.IDNo.12、鸽子源性探针Seq.IDNo.13、石鸡源性探针Seq.IDNo.14。2.根据权利要求1所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于：所述鸡源性探针的5’端用FAM修饰，所述鸭源性探针的5’端用HEX修饰，所述鹅源性探针的5’端用TAMRA修饰，所述鹌鹑源性探针的5’端用FAM修饰，所述鸽子源性探针的5’端用HEX修饰，所述石鸡源性探针的5’端用TAMRA修饰，所述探针的3’端分别用NFQ-MGB修饰。3.检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照。4.根据权利要求3所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述通用上游引物和通用下游引物的浓度分别为30μmol/L；所述鹌鹑上游引物、鹌鹑下游引物、鸽子上游引物、鸽子下游引物、石鸡上游引物和石鸡下游引物的浓度分别为10μmol/L，所述鸡源性探针、鸭源性探针、鹅源性探针、鹌鹑源性探针、鸽子源性探针和石鸡源性探针的浓度分别为10μmol/L。5.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙端方，孙棣，肖洋，董睿，李春宇，田志强，张谦，黄家瑞，
申请(专利权)人：贵州省产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：贵州,52