制备脊椎动物淋巴细胞和生产结合蛋白的方法技术

本发明专利技术总体上涉及遗传工程和抗体生产领域。具体地讲，它涉及遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞的制备，所述淋巴细胞具有分化成更成熟的淋巴系细胞的能力，并且涉及将其用于生产任何异源抗体或结合蛋白的用途。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,以及将其用于生产异源结合蛋白 ...的制作方法
本专利技术总体上涉及遗传工程和抗体生产领域。具体地讲，它涉及遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞的制备，所述淋巴细胞具有分化成更成熟的淋巴系细胞的能力，并且涉及将其用于生产任何异源抗体或结合蛋白的用途。
技术介绍
业已证实单克隆抗体对于疾病的诊断、预防和治疗来说都是有效的制剂(Glennie和Johnson，Immunol.Today，21，p.403-410，2000)。这是由于它们通过其可变区非常特异地结合在靶分子(抗原)上的特定表位上的独特能力，同时，还由于能通过它们的恒定区结构域介导效应物功能(Frazer和Capra，Fundamental Immunology，W.E.Paul(Ed.)，Fourth Edition，p.37-74，1999)(图1)。这使得单克隆抗体能够特异性地鉴定大分子的复杂混合物中的独特抗原，并且产生针对所述靶分子的效应物功能。抗体(或免疫球蛋白)由通过二硫键连接在一起的两个相同的重(H)链和轻(L)链糖蛋白(图1)组成。每一个H和L链包括在不同的抗体之间是相同的N-末端可变区和C-末端恒定区，该区在属于相同的免疫球蛋白同种型的不同抗体中是相同的(图1)。H和L链可变区的组合，产生了抗体的抗原结合袋，并且决定其特异性(或独特型)，而所述恒定区决定其同种型(Frazer和Capra，s.a.)。由于VH和VL结构域是由被称为V(可变的)，D(多样性；仅存在于H链基因座上)和J(结合)基因片段的多个基因片段编码的这一事实，导致了免疫球蛋白的可变性(Tonegawa，Nature，302，p.575-581，1983)(图1)。在B淋巴细胞分化期间，在每一个细胞中随机选择V，D和J基因片段，进行V(D)J重组的位点特异性重组过程，该过程能组装所述基因片段，以便产生VH或VL结构域的新的编码区(Grawunder等，Curr.Opin.Immunol.，10，p.172-180，1998)。由于所述多个V，D和J基因片段，以及基因片段结合中的不精确性，免疫系统每天产生的数百万个B淋巴细胞，能够产生具有不同V区特异性的大量所有组成成分(repertoire)(Melchers等，Curr.Opin.Immunol.，7，p.214-227，1995)。在进化期间，在不同的物种之间免疫球基因具有微小的差别，以便不同物种之间的抗体的恒定区有所不同。其后果是，来自一个物种的免疫球蛋白如果被导入另一个物种的血管系统，最常见是免疫原性的。因此，异种单克隆抗体的免疫原性限制了它们在治疗人类疾病方面的应用，因为患者接触异种抗体可能导致负面作用，甚至是急性毒性，或者可能简单地导致所使用的抗体的中和与清除，从而减弱其药理学效力(Clark，Immunol Today，21，p.397-402，2000)。相反，给患者施用完全的人抗体，通常不会导致任何上述并发症。业已偶尔从各个患者的血液中分离了人类抗血清或人类多克隆抗体，以便治疗或预防罕见的，并且通常是高度致命的疾病，如埃博拉病毒感染，或者，用于治疗接触蛇毒之后的个体。不过，由于多种原因，这种方法对于治疗影响较大群体的疾病是不实用的。另外，出于伦理考虑，不可能为了生产单克隆抗体而用特定抗原对人类进行免疫，因为人体内产生需要的抗体的B系细胞，是在次级淋巴器官中发育和存留的，并且不能方便地获得。另外，治疗性抗体，特别是用于癌症治疗的抗体的很多潜在的靶抗原是人类蛋白(Glennie和Johnson，s.a.)。在正常环境下，人类不会产生针对所述靶的抗体。因此，最近主要的努力一直集中在建立不需要人类免疫系统的开发治疗性人类或人源化抗体的方法。最简单的方法，利用标准遗传工程技术由分泌具有所需特异性的异种抗体的杂交瘤克隆编码H和L链的可变区(VH和VL结构域)的cDNAs。然后将克隆的可变区cDNAs克隆到含有人类恒定区基因的合适的大肠杆菌，酵母，昆虫或哺乳动物细胞表达载体中。这样可以生产具有与人类CH和CL恒定区结构域融合的异种VH和VL的单克隆抗体，从而得到人源化抗体。不过，该方法的缺陷是，异种VH和VL结构域与人类CH和CL恒定区的融合，可能导致减弱了的亲和力或改变了的特异性。另外，所述人源化抗体的异源VH和VL在人体内仍然是免疫原性的，因为V结构域的构架区在不同物种之间是不同的。在某些场合下，这一问题可以通过将介导直接接触抗原的各个互补性决定区(CDRs)嫁接到H和L链可变的人类构架区上而得到克服(Fiorentini等，Immunotechnology，3，p.45-59，1997)。不过，由于未知原因，CDR嫁接通常仍然会导致免疫原性抗体的产生和/或亲和力和特异性的减弱/丧失。因此，为了制备完整的人类免疫球蛋白，近年来业已开发了两种不同的并且更有效的方法。第一种方法基于单链可变区(scFv)的表达(展示)，所述scFv由位于大肠杆菌的丝状噬菌体表面上的一个VH和VL结构域组成(Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21，p.371-3818，2000)(还可参见EP 0 585 287B1，EP 0 605 522B1)。可以构建含有VH和VL链的各种所有组成成分的噬菌体展示文库，可以构建包括不同的VH和VL链的所有组成成分的噬菌体展示文库，并且，通过重组噬菌体与固定化抗原的结合，可以从所述文库中分离各个scFv特异性(McCafferty等，Nature，348，p.552-554，1990)。源于天然人类所有组成成分的scFv结合蛋白的噬菌体展示文库具有这样的缺陷它局限于包含在所述所有组成成分中的特异性，因此，很多人类抗原的特异性最常见的是不存在于所述文库中。尽管可以利用组合的或合成的噬菌体展示文库来克服这一问题，该技术的一般缺陷是，通常不能分离特定抗原的高亲和力结合蛋白。因此，很大的精力一直投入在通过费力的克隆或位点特异性重组方法，构建非常大的原始文库。估计最佳组合或合成的文库含有109-1011个潜在的不同结合位点，并且可以产生1-200nM范围内的结合特异性(Hoogenboom和Chames，s.a.)。不过，在体内，在生发中心B细胞中的免疫球蛋白亲和成熟期间，可以达到的在皮摩尔范围(10-12M)内的较高的亲和力，只能在采用额外的烦琐的遗传工程方法时才能产生，包括V基因混排，易错PCR，使用大肠杆菌突变菌株等。无论噬菌体展示文库筛选方法的结果是什么，最终都需要将编码scFv结合位点的基因重新克隆到合适的表达载体中，用于表达人类免疫球蛋白，并且需要将所述载体稳定地转入可以大规模生产人类抗体的细胞表达系统中，这是另一个耗费时间和昂贵的过程。用于生产完全的人单克隆抗体的第二种方法，是基于具有人类免疫球蛋白H和L链基因座的构建体的转基因小鼠的用途(Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.，6，p.561-566，1995)。将所述人类免疫球蛋白转基因最终转育到不再能组装内源鼠抗原受体基因的遗传背景中。在所述小鼠中，B系细胞的发育取决于来自人类转基因构建体的免疫球蛋白H和L链的表达，所述小鼠的B系细胞只能产生人类抗体。该技术存在三种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备脊椎动物淋巴细胞的方法，可将其用于生产任何异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段，包括以下步骤：（ａ）通过导入编码至少一种异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段的至少一种外源遗传元件对脊椎动物前体淋巴 细胞进行遗传修饰，所述淋巴细胞（ｉ）源于初级淋巴器官，和（ｉｉ）具有分化成成熟的淋巴系细胞的潜力；以及（ｂ）在体外或体内实现将所述遗传修饰过的前体淋巴细胞分化成成熟的淋巴系细胞，以便制备能够生产所述异源抗体，抗原受体 ，人工结合蛋白，或其功能性片段的淋巴细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔夫格拉温德，格奥尔格弗里德里希梅尔，
申请(专利权)人：四抗体股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]