本氏烟TMP14蛋白及其在抗植物病毒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了本氏烟TMP14蛋白及其在抗植物病毒中的应用。所述本氏烟TMP14蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。本发明专利技术还公开了本氏烟TMP14蛋白的一个优化突变体。本发明专利技术的本氏烟TMP14蛋白与TSWV NSm存在直接互作，其过表达转基因烟草植株具有抗植物病毒的功能，该发现对于研究转基因抗病毒农作物提供了理论及实践基础，具有广阔的应用前景。

TMP14 protein of Benedict and its application in anti plant virus

The invention discloses the TMP14 protein of Benedict and its application in the anti plant virus. The amino acid sequence of the Nicotiana benthamiana TMP14 protein shown in a sequence table SEQ ID NO1. The invention also discloses an optimized mutant of the TMP14 protein of Benedict. The direct interaction of the invention has the homologous TMP14 protein and TSWV NSm, the transgenic tobacco plants with anti virus function, this discovery provides a theoretical and practical basis for the study of genetically modified crops, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
本氏烟TMP14蛋白及其在抗植物病毒中的应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种本氏烟TMP14蛋白及其在抗植物病毒中的应用。
技术介绍
TMP14是一种定位于叶绿体类囊体膜的磷酸化蛋白(thylakoidmembranephosphoprotein,TMP)。对拟南芥TMP14(AtTMP14)研究表明，该蛋白由核基因编码，前体包含45个氨基酸组成的叶绿体信号肽。AtTMP14的分子量为14kDa，推测N末端位于叶绿体基质，中间区域包含2个跨膜螺旋，21或22位的苏氨酸为磷酸化位点。TMP14是植物、蓝藻等光合生物编码的一种特有蛋白，但在光合作用中的具体功能迄今尚不明了。最新研究表明，TMP14是植物光系统-I(photosystemI,PSI)色素-蛋白复合体的组成亚基之一，故又命名为PSI-P，推测其在植物光反应中具有重要作用。NbTMP14是本氏烟叶绿体光系统-I的组成亚基，基因全长549nt，编码的前体蛋白包含20个氨基酸组成的叶绿体信号肽。番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的代表种，由西花蓟马传播，侵染寄主1000余种，在植物的叶片、茎秆、果实等器官引发褪绿、坏死、环斑等典型症状，严重危害全球农业生产。NSm是Tospovirus病毒特有的编码蛋白，NSm在Tospovirus病毒与寄主植物互作过程中具有非常重要的作用。利用生物化学、组织化学等方法对TSWVNSm研究发现，NSm具有运动蛋白(movementprotein,MP)的典型特征，如：1)与细胞质膜、细胞壁结合紧密，2)RNA亲和，3)定位于胞间连丝，4)修饰胞间连丝。目前，尚没有关于TMP14蛋白与TSWVNSm蛋白互作，并且抵抗植物病毒的报道，本氏烟TMP14蛋白的作用还未知。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种本氏烟TMP14蛋白及其编码基因。本专利技术的目的还在于提供本氏烟TMP14蛋白与TSWVNSm蛋白互作及其在抗植物病毒中的应用。一种本氏烟TMP14蛋白，所述本氏烟TMP14蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO1所示。所述本氏烟TMP14蛋白的基因序列如序列表SEQIDNO2所示。上述本氏烟TMP14蛋白的基因载体。上述本氏烟TMP14蛋白的基因载体的宿主菌。扩增上述的本氏烟TMP14基因中任一片段的引物。一种本氏烟TMP14蛋白突变体，所述本氏烟TMP14蛋白突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNO3所示。上述本氏烟TMP14蛋白突变体，其基因序列如序列表SEQIDNO4所示。上述本氏烟TMP14蛋白与TSWVNSm蛋白的互作。上述本氏烟TMP14蛋白和本氏烟TMP14蛋白突变体在抵抗植物病毒中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术的本氏烟TMP14蛋白与TSWVNSm存在直接互作；其过表达转基因烟草植株具有抗植物病毒的功能，该发现对于研究转基因抗病毒农作物提供了理论及实践基础，具有广阔的应用前景；其突变蛋白具有更加优良的抗植物病毒功效。附图说明图1为本氏烟TMP14蛋白和TSWVNSm蛋白互作的酵母双杂交图。图2双荧光互补方法验证本氏烟TMP14和TSWVNSm互作。图3本氏烟接种TSWV及VIGS下调TMP14症状表现；图中，A.TSWV接种10天后与健康植株比较；B.TRVVIGS方法沉默TMP14症状表现；C.接种TSWV10天后qPCR检测TMP14表达量；D.qPCR检测TMP14沉默效果。图4为电子显微镜观察接种TSWV和下调TMP14表达后本氏烟叶绿体形态。图5TMP14表达下调的本氏烟植株接种TSWV症状表现及病毒积累量检测。图6转TMP14基因本氏烟鉴定及TSWV攻毒试验；图中，A.接种TSWV10天后症状表现；B.qPCR分析TMP14表达量；C.TSWV积累量检测；D.WesternBlot检测转基因植株。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1TSWVNSm与本氏烟TMP14存在直接互作分别将TSWVNSm插入到pBT3-STE、NbTMP14插入到pPR3-N，得到pBT3-STE-NSm与pPR3-N-TMP14两个载体。将这两种载体同时转入到酵母菌株NMY51中，同时以pBT3-STE-NSm和空载体pPR3-N，与pPR3-N-TMP14和空载体pBT3-STE共转化酵母作为两组阴性对照，涂酵母二缺板，再经过菌液PCR鉴定出阳性克隆。将阳性克隆摇菌后收集菌体，稀释成不同浓度，进一步涂酵母三缺板，观察三缺板的长势。结果显示pBT3-STE-NSm与pPR3-N-TMP14共转化的酵母能够在三缺板上正常生长，而pBT3-STE-NSm与空载体pPR3-N、pPR3-N-TMP14与空载体pBT3-STE共转化的酵母则受到抑制，说明TSWVNSm与本氏烟TMP14存在直接互作(图1)。将NbTMP14和TSWVNSm分别插入到双分子荧光载体YFPN和YFPC中，得到TMP14-YFPN和NSm-YFPC两个载体。将TMP14-YFPN和NSm-YFPC载体转化到农杆菌GV3101中。利用农杆菌侵染的方式，分别对本氏烟共注射TMP14-YFPN和NSm-YFPC农杆菌，36h-48h左右时观察TMP14的定位。发现在野生型本氏烟中，有黄色荧光蛋白，且定位在叶绿体上，这也进一步验证了TMP14与NSm的互作，且互作的位置发生在叶绿体中(图2)。以上结果证明，本氏烟TMP14蛋白与TSWVNSm存在直接互作。NSm是TSWV编码的一种重要的多功能蛋白。介导病毒完成胞间运动，且和症状发生相关。TMP14与之互作在病毒侵染过程中发挥的作用有待进一步研究。实施例2TSWV接种本氏烟导致TMP14表达下调和叶绿体发育异常本氏烟摩擦接种病毒TSWV，观察烟草发病症状，在接种10天后，本氏烟系统叶片出现明显的黄化萎蔫症状。取发病叶片提取总RNA,RT-PCR确认病毒侵染后，qPCR检测TMP14表达量，发现TMP14的表达量与健康烟草相比明显降低(图3中的A,C)。同时取发病叶片利用电子显微镜观察细胞结构，发现接种病毒后烟草的叶绿体明显比野生型烟草的叶绿体上的淀粉粒要大，而且叶绿体的结构受到破坏，并且形态发生明显变化(图4)。为了进一步确定病毒症状发生和TMP14表达下调的关系，利用TRVVIGS的方式，将其表达下调。分别构建pTRV2-GFP、pTRV2-TMP14两个载体；通过转化农杆GV3101，pTRV2-GFP、pTRV2-TMP14分别与TRV11:1混合后注射烟草；注射后10天出现明显黄化的表型，qPCR检测本氏烟TMP14表达量下降(图3中的B,D)，利用电镜观察叶绿体的形态，发现沉默TMP14的烟草叶绿体和对照本氏烟的叶绿体的形态相比受到严重破坏(图4)。实施例3下调本氏烟TMP14表达有利于TSWV侵染，上调则对其抗性提高1.TRVVIGS沉默TMP14表达后导致TSWV积累量上调TRV2-GFP、TRV2-TMP14分别与TRV11:1混合后注射烟草；注射后10天，取样检测这两种烟草中TMP14的表达量，结果发现TRV2-TMP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种本氏烟TMP14蛋白，其特征在于，所述本氏烟TMP14蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。

【技术特征摘要】
1.一种本氏烟TMP14蛋白，其特征在于，所述本氏烟TMP14蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2.根据权利要求1所述本氏烟TMP14蛋白，其特征在于，所述本氏烟TMP14蛋白的基因序列如序列表SEQIDNO2所示。3.一种含权利要求1所述本氏烟TMP14蛋白的基因载体。4.含有权利要求3所述本氏烟TMP14蛋白的基因载体的宿主菌。5.扩增权利要求1所述的本氏烟TMP14基因中任一片段的引物。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永强，张超，占锦，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11